拮抗石榴枯萎病病原甘薯長(zhǎng)蠕殼生防真菌的篩選

拮抗石榴枯萎病病原甘薯長(zhǎng)蠕殼生防真菌的篩選

甘薯是一種廣泛分布于甘薯、咖啡、甘薯、芋頭等30多種木本植物的疾病。這主要是由于甘薯、李子和豆類(lèi)的黑斑疹、石榴萎縮和芋頭的黑腐病。目前,我國(guó)每年因黑斑病造成的甘薯產(chǎn)量損失達(dá)5%~10%,并且其主要防治藥劑多菌靈、甲基硫菌靈已引起耐藥性及交互抗性。我國(guó)石榴枯萎病先后發(fā)生于云南蒙自縣、四川攀西及會(huì)理,2003年蒙自萬(wàn)畝石榴園病株率達(dá)11.2%,Huang于2008年報(bào)道蒙自芋頭黑腐病病原菌甘薯長(zhǎng)喙殼。目前,尚未發(fā)現(xiàn)良好的田間應(yīng)用農(nóng)藥,而生防菌枯草芽孢桿菌YZS-B15、熒光假單胞菌YZS-Ph02組合及HB在盆栽實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出相近的效果,由此可見(jiàn),土著微生物在植物病害的防治中具有更好的應(yīng)用前景。研究表明,土壤根際微生物與植物生長(zhǎng)具有密切的聯(lián)系,一些微生物能在植物體根系周?chē)纬梢粋€(gè)保護(hù)屏障作用,釋放難溶礦質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)元素以及產(chǎn)生促生、抗菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物,對(duì)植物的發(fā)育、生長(zhǎng)、抗病具有促進(jìn)效果。本研究以分離自蒙自石榴枯萎病、芋頭黑腐病的病原菌甘薯長(zhǎng)喙殼為指示菌,采用平板對(duì)峙生長(zhǎng)法從石榴根際土壤篩選拮抗真菌,旨在為蒙自甘薯長(zhǎng)喙殼病害的防治及病壤的生物修復(fù)提供菌株來(lái)源。1材料和方法1.1馬鈴薯yp1和龍血樹(shù)紫斑病石榴枯萎病甘薯長(zhǎng)喙殼XAS-1由本課題組分離自云南蒙自新安所小寨村病干,芋頭黑斑病甘薯長(zhǎng)喙殼菌YP1由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黃瓊教授惠贈(zèng),另有小桐子果腐病Bgf-1、芒果果腐病Mg-1、也門(mén)鐵葉斑病Ymt-2和龍血樹(shù)紫斑病Lzb-6(尚未發(fā)表資料),均由本課題組分離自紅河州。上述菌株保存在紅河學(xué)院植物病原菌鑒定及防治實(shí)驗(yàn)室。1.2方法1.2.1采樣點(diǎn)樣點(diǎn)土樣的采集選擇云南蒙自新安所小寨村約0.2hm2樣地,該樣地中有一排水溝,一側(cè)約80%的石榴死亡或枯萎,一側(cè)生長(zhǎng)旺盛。在排水溝兩側(cè)以“S”布點(diǎn)采樣,各取5點(diǎn),采樣深度15~20cm(靠近石榴須根系1cm處),每個(gè)樣點(diǎn)取土樣約30g[8〗。于2011年9月、2012年4月、2012年8月各采樣1次。將土樣粉碎混勻,用100目的篩子除去沙粒、枝葉碎屑等,每份取10g碎土樣依次稀釋為10-2、10-3、10-4、10-5稀釋液;然后各取30μL涂布在PDA培養(yǎng)基上,28℃恒溫培養(yǎng)3~5d,挑取不同形態(tài)菌絲或分生孢子轉(zhuǎn)接28℃培養(yǎng)3~5d,然后鏡檢,若不純則繼續(xù)純化直至獲得純培養(yǎng)菌株。1.2.2抗菌材料檢測(cè)初篩時(shí)用打孔器取直徑為5mm的病原菌餅于PDA平板中央,再分別取直徑為5mm的土壤真菌純菌株點(diǎn)接在距病原菌3cm處,每個(gè)平板接6株不同菌株,呈正六邊形。28℃培養(yǎng)5~7d后觀察是否有抑菌帶或病原菌菌絲死亡、消減,具備上述現(xiàn)象者即為拮抗菌株。抑菌率測(cè)定時(shí),方法類(lèi)上,采取“三點(diǎn)接種法”,每個(gè)拮抗菌株3個(gè)重復(fù),以無(wú)菌培養(yǎng)基餅作為對(duì)照。28℃恒溫培養(yǎng)3~4d后測(cè)量病原菌與拮抗菌株間的抑菌帶寬。1.2.3脂培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)孢真菌鑒定產(chǎn)孢菌株直接鑒定,不產(chǎn)孢真菌則利用光照、改良番茄汁瓊脂培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)孢[9〗,然后觀察并測(cè)量、記錄真菌的菌落特征及菌絲、分生孢子、分生孢子梗等微觀特征,然后根據(jù)魏景超《常見(jiàn)真菌鑒定手冊(cè)》[10〗及相關(guān)文獻(xiàn)鑒定到屬。2結(jié)果與分析2.1不同施肥期、不同生長(zhǎng)植株根際土壤真菌的多樣性先后從健康石榴根際土壤分離真菌56株、患病石榴根際土壤分離真菌43株,共分離99株(表1)。結(jié)果表明,健康植株的根際土壤真菌比病株根際土壤真菌的多樣性高,健康植株根際土壤真菌在施肥后的石榴發(fā)芽期較為豐富,而患病植株根際土壤真菌隨時(shí)間推移日趨豐富。這可能是因?yàn)榇杭就寥澜?jīng)施肥和上一年度樹(shù)葉腐爛后有機(jī)質(zhì)含量增加促進(jìn)健康植株根際真菌的繁殖,從而增強(qiáng)僅有一排水溝之隔的健康植株抵御甘薯長(zhǎng)喙殼侵染的能力;病害植株雖未經(jīng)施肥,但隨著石榴發(fā)病程度加重導(dǎo)致的根系腐爛程度日益嚴(yán)重,為主要分解纖維素為生的真菌繁殖提供了營(yíng)養(yǎng)。2.2抗菌材料對(duì)甘薯長(zhǎng)酵母菌抗氧化能力的影響如表2所示,從99株土壤真菌中篩選到5株石榴枯萎病甘薯長(zhǎng)喙殼拮抗菌,其中4株分離自健康植株根際土壤,3株拮抗芋頭黑腐病甘薯長(zhǎng)喙殼,HCAF-19、HCAF-02對(duì)兩種甘薯長(zhǎng)喙殼的抑菌能力較強(qiáng),但5株拮抗菌對(duì)其他4株病原菌均無(wú)拮抗活性。2.3菌落、病原菌及菌株的初分分析拮抗菌株在PDA上均不產(chǎn)孢,經(jīng)光照和番茄汁瓊脂培養(yǎng)基(TCJ)誘導(dǎo),全光照或12h間歇光照能促進(jìn)HCAF-33、DCAF-42產(chǎn)孢,5株拮抗菌在全光照、12h間歇光照、全黑暗等3種條件下的TCJ培養(yǎng)基上均能產(chǎn)孢。HCAF-02:在PDA、TCJ上菌落均中央黑色、邊緣白色,致密,背面藍(lán)黑色;菌絲黑色,有隔,分枝;分生孢子由無(wú)色的特化菌絲斷裂形成,表面光滑,無(wú)隔,棍棒狀或短桿狀。HCAF-19:在PDA、TCJ上菌落正、背面均呈白色,邊緣不整齊,呈蓮花狀輪紋,稀疏;菌絲白色,有隔,分枝;分生孢子梗明顯分化,散生,其上輪生產(chǎn)孢瓶梗;分生孢子黑色,無(wú)隔,橢圓形或圓形,平均直徑7.58μm。HCAF-33:在PDA、TCJ上菌落正面均呈白色或黃褐色,毯狀,致密;菌絲白色,有隔,分枝;分生孢子梗對(duì)生,其上著生對(duì)生的小瓶梗,瓶梗上單生分生孢子;分生孢子淡黃色,無(wú)隔,球形,平均直徑8.86μm。HCAF-54:在PDA、TCJ上菌落正面均呈黑色、背面藍(lán)黑色,平鋪生長(zhǎng),致密;菌絲黑色,有隔,分枝;分生孢子梗簇生,褐色,頂部彎曲;分生孢子褐色,無(wú)隔,短桿狀。DCAF-42:在PDA、TCJ上菌落正面均呈白色,平鋪生長(zhǎng),致密;菌絲黑色,有隔,分枝;分生孢子梗頂部膨大為橄欖形頂囊,頂囊上著生葡萄串狀的產(chǎn)孢細(xì)胞,產(chǎn)孢細(xì)胞全壁芽生式產(chǎn)孢;分生孢子綠色,無(wú)隔,橢圓形。根據(jù)菌落、菌絲、分生孢子梗及孢子形態(tài),結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》[10〗,可以初步確定菌株HCAF-02為節(jié)卵孢屬(Oosporasp.);菌株HCAF-19為輪枝孢屬(Verticilliumsp.);菌株HCAF-33為木霉屬(Trichodermasp.);菌株HCAF-54為褐孢霉屬(Fulviasp.);菌株DCAF-42為葡孢霉屬(Botryosporiumsp.)。3甘薯黑斑病甘薯長(zhǎng)論檢測(cè)菌株的基因型鑒定本試驗(yàn)從30份石榴根際土樣中分離到99株真菌,篩選到拮抗石榴枯萎病病原菌甘薯長(zhǎng)喙殼的生防菌五株,分別是:HCAF-02節(jié)卵孢屬(Oosporasp.)、HCAF-19輪枝孢屬(Verticilliumsp.)、HCAF-33木霉屬(Trichodermasp.)、HCAF-54褐孢霉屬(Fulviasp.)、DCAF-42葡孢霉屬(Botryosporiumsp.);其中菌株HCAF-02節(jié)卵孢屬(Oosporasp.);HCAF-19輪枝孢屬(Verticilliumsp.);HCAF-54褐孢霉屬(Fulviasp.)同時(shí)拮抗分離自芋頭黑腐病的病原菌甘薯長(zhǎng)喙殼。菌株HCAF-02、HCAF-19具有高拮抗活性,具備防治蒙自石榴、芋頭甘薯長(zhǎng)喙殼病害的應(yīng)用前景。分離自石榴、芋頭的甘薯長(zhǎng)喙殼中國(guó)菌株具有高度一致的基因同源性,均能跨寄主侵染,而甘薯黑斑病甘薯長(zhǎng)喙殼具有