胰蛋白酶在胰腺癌疼痛中的作用

胰蛋白酶在胰腺癌疼痛中的作用陸智杰，吳飛翔，繆雪蓉，俞衛(wèi)鋒【摘要】目的觀看胰腺癌疼痛患者的胰腺腫瘤標(biāo)本內(nèi)胰蛋白酶的mRNA及其蛋白的表達(dá)。方式取視覺模擬疼痛評(píng)分(VAS)在5分以上的胰腺腫瘤患者的新鮮組織標(biāo)本，采納RT-PCR及ELISA的方式對(duì)胰蛋白酶的mRNA及其蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果胰腺癌組織中人胰蛋白酶mRNA水平明顯高于正常胰腺組織，ELISA顯示胰腺癌組織的胰蛋白酶水平明顯增高，與正常胰腺組織相較，不同具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<。結(jié)論高水平的胰蛋白酶可能通過激活PAR-2介導(dǎo)胰腺癌疼痛的?！娟P(guān)鍵詞】胰蛋白酶；胰腺腫瘤；疼痛；蛋白酶活化受體-2Abstract：ObjectiveTostudythetrypsinexpressioninpancreatictumorspecimenfrompancreaticcarcinomapatientswithpain.MethodsRT-PCRandELISAwereusedtoidentifytrypsinmRNAanditsexpressioninfreshtissuespecimenfromthepancreaticcarcinomapatientswithVAS(visualachesimulation)scoreN5.ResultsThemRNAlevelwassignificantlyhigherinpancreaticcarcinomatissuethaninnomalpancreatictissue.AndoutcomeofELISAshowedtrypsinlevelofpancreaticcarcinomatissuesignificantlyincreasedcomparedwiththatofnomalpancreatictissue(P<.ConclusionHighexpressionoftrypsinisfoundinpancreaticcarcinomapatientswithpain,whichmaymediatenociceptionbyactivationofprotease-activatedreceptor-2inprimarysensoryneurons.Keywords: trypsin;pancreaticcarcinoma;pain;protease-activatedreceptor-21991—2000年來，中國(guó)胰腺癌病死率水平在不斷上升，65歲以上人群尤其明顯［1］。胰腺癌患者發(fā)生疼痛極為常見，胰腺癌患者的疼痛發(fā)生率及其嚴(yán)峻程度與腫瘤程度相關(guān)，約30%~60%病灶相對(duì)局限的初期胰腺癌患者和逾80%的進(jìn)展期胰腺癌患者有癌痛體驗(yàn)，患者死亡前的癌痛發(fā)生率更高達(dá)90%。胰蛋白酶(Trypsin)為蛋白酶的一種，在胰臟是作為酶的前體胰蛋白酶原而被合成的，是肽鏈內(nèi)切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷。它不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前體，起活化作用。胰蛋白酶還可激活蛋白酶活化受體-2(protease-activatedreceptor，PAR-2)，最近幾年來，發(fā)覺蛋白酶活化受體-2可能介導(dǎo)胰腺炎的疼痛［2］，給清醒大鼠胰管內(nèi)注入胰蛋白酶和PAR-2特異性肽興奮劑均能夠引發(fā)疼痛行為反映。在胰腺炎癥時(shí)，胰腺組織胰蛋白酶可激活PAR-2，在胰腺癌發(fā)生時(shí)，是不是一樣具有蛋白酶的高表達(dá)呢？為此，咱們選取東方肝膽外科醫(yī)院確診的胰腺癌病例，視覺模擬疼痛評(píng)分(VAS)在5分以上的胰腺腫瘤患者的新鮮組織標(biāo)本，對(duì)胰蛋白酶的mRNA及其蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證胰蛋白酶是不是高表達(dá)，并激活PAR-2引發(fā)胰腺癌疼痛。1材料與方式實(shí)驗(yàn)材料選取人胰腺癌患者的腫瘤新鮮組織。人胰蛋白酶ELISA試劑盒為武漢中美科技產(chǎn)品?？捡R斯亮藍(lán)試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品°RT-PCR試劑盒為德國(guó)Qiagen公司產(chǎn)品。Tag酶為美國(guó)BioLabs公司產(chǎn)品。標(biāo)本的選取及分組分為兩組，實(shí)驗(yàn)組10例為胰腺癌組，視覺模擬疼痛評(píng)分(VAS)在5分以上；對(duì)照組10例為正常胰腺組織組。RT-PCR方式檢測(cè)人胰蛋白酶mRNA的表達(dá)人胰蛋白酶基因序列由Genebank取得，據(jù)其序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物序列如下：5-CATGTTCTGTGTGGGCTTCCT-3；5-GTAGACCTTGGTGTAGACTCC-3。取預(yù)標(biāo)本勻漿，加入Trizol試劑1ml，振蕩15s混勻后，加入酚200ul，混勻，加入氯仿：異戊醇溶液200ul，混勻。4°C，15000r/min離心10min，抽取上清入新管；加入400ul氯仿：異戊醇溶液，混勻后4°C,15000r/min離心10min，抽上清入新管，用500ml異丙醇室溫下沉淀10min,4C,15000r/min離心10min,棄上清，用70%乙醇溶液1ml清洗2次，溶解于Milliq水50ul中，分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度-80C低溫保留。而后以上述引物行RT-PCR，解鏈溫度為54C，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。ELISA檢測(cè)人胰蛋白酶水平的轉(zhuǎn)變?nèi)≌Ｒ认俳M織及胰腺癌組織，勻漿后考馬斯亮藍(lán)測(cè)定總蛋白，采納雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)，將抗人胰蛋白酶單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的人胰蛋白酶與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠人胰蛋白酶，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入酶底物OPD，顯現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在450nm處測(cè)OD值，人胰蛋白酶濃度與OD值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中人胰蛋白酶濃度。統(tǒng)計(jì)學(xué)方式計(jì)量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)比較均采納近似F查驗(yàn)(SNK-q)，P<具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果手術(shù)標(biāo)本的選取成功獲取人胰腺癌組織標(biāo)本10例，其中7例病理為胰頭腺癌，3例為胰體尾腺癌。所有患者視覺模擬評(píng)分(visualanaloguescale，VAS)>5分。另獲取對(duì)照組正常胰腺組織標(biāo)本10例。RT-PCR方式檢測(cè)人胰蛋白酶mRNA的表達(dá)RT-PCR測(cè)定人胰蛋白酶mRNA水平，可擴(kuò)增出134bp的序列，如圖1所示。胰腺癌組織中人胰蛋白酶mRNA水平明顯高于正常胰腺組織。圖1RT-PCR示胰腺及胰腺癌組織中胰蛋白酶mRNA水平ELISA檢測(cè)人胰蛋白酶水平的轉(zhuǎn)變ELISA測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程加二6,相關(guān)系數(shù)R2=1，具有良好的相關(guān)性。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。依照所測(cè)的OD值及標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)胰腺癌及正常胰腺組織的胰蛋白酶值進(jìn)行計(jì)算，胰腺癌組織的胰蛋白酶水平明顯高于正常胰腺（P<）。詳見表1（因胰腺癌組有3例胰腺組織壞死，未能檢測(cè)，故測(cè)了7例。為方便比較，正常組也測(cè)了7例）。表1胰腺癌與正常胰腺組織中胰蛋白酶水平比較3討論胰腺癌的腹痛表現(xiàn)多種多樣，并可在胰腺癌病程及診治進(jìn)程中發(fā)生轉(zhuǎn)變。典型腹痛表現(xiàn)為上腹部疼痛，腹痛性質(zhì)常見上腹鈍痛、陣發(fā)性猛烈上腹痛和涉及腰背部的上腹痛。本研究所選擇的方式，多是以上腹痛為首發(fā)病癥［3］,視覺模擬疼痛評(píng)分(VAS)都在5分以上。晚期胰腺癌疼痛相當(dāng)猛烈，不僅為軀體方面的疼痛，而是涉及社會(huì)、心理和精神方面的全方位疼痛，常伴有強(qiáng)烈的自主神經(jīng)系統(tǒng)和心理學(xué)異樣，部份患者對(duì)癌痛的恐懼乃至超過對(duì)死亡的恐懼。因此，癌痛操縱已成為患者的第一需要和組成胰腺癌姑息醫(yī)治不可缺少的重要組成部份。胰蛋白酶為蛋白酶的一種，而在胰腺癌的患者中，半數(shù)以上顯現(xiàn)胰蛋白酶增高。腫瘤侵犯正常胰腺，可致使胰蛋白酶被激活。另外腫瘤組織中也可能分泌其他能夠激活PAR-2的蛋白酶。因此，腫瘤組織完全有可能通過這些蛋白酶直接激活低級(jí)傳入感覺神經(jīng)元，繼而將損害性感受信號(hào)逐級(jí)傳遞到中樞，這極可能是胰腺癌疼痛的重要的發(fā)生和維持機(jī)制之一。在本研究中，通過ELISA及RT-PCR方式對(duì)胰腺癌組織中胰蛋白酶及其mRNA水平進(jìn)行測(cè)定，發(fā)覺胰腺癌組織中胰蛋白酶及其mRNA水平明顯高于正常胰腺組織(P<)，這說明胰腺癌發(fā)生時(shí)胰蛋白酶的水平及蛋白水解酶的活性都明顯升高，這可能與胰腺癌的發(fā)生有關(guān)。但同時(shí)，也增進(jìn)胰蛋白酶及蛋白水解酶與PAR-2結(jié)合，激活PAR-2,通過細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，傳遞痛覺信號(hào)，致使胰腺癌疼痛的發(fā)生。這與Kayssi等［4］在結(jié)腸的研究中一致，以為胰蛋白酶及PAR-2以自分泌、正反饋的方式在增進(jìn)腫瘤增生的同時(shí)，也激活了MAPK-ERK通路，同時(shí)抑制了亦電流，從而使DRG神經(jīng)元處于快樂奮狀態(tài)，維持長(zhǎng)期的內(nèi)臟痛。胰蛋白酶是最有效的PAR-2激活劑［5］,可激活胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的PAR-2。活化的PAR-2可通過磷酸肌醇、酪氨酸磷酸化、蛋白激酶C、Ca2+等介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最近幾年來研究要緊集中在細(xì)胞外信號(hào)調(diào)劑激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,ERK)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［6~7］°PAR-2激活劑能經(jīng)多種途徑激活ERK1/2,ERK1/2激活后可使細(xì)胞骨架蛋白、微管相關(guān)蛋白和磷脂酶A2磷酸化，啟動(dòng)多種細(xì)胞質(zhì)反映，ERK還可通過激活cAMP反映元件結(jié)合蛋白(cAMPresponseelementbindingprotein,CREB)，以CREB依托性的方式調(diào)控下游基因的表達(dá)，包括c-fos、NK-一、強(qiáng)啡肽和BDNF等［8］。在大鼠CCI的神經(jīng)病理性疼痛模型中，鞘內(nèi)注射ERK抑制劑U0126或ERK反義寡核苷酸可減弱機(jī)械性的超敏和痛覺過敏，這說明ERK信號(hào)通路與CCI誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)［9］。因此，蛋白水解酶-PAR-2-ERK-CERB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是胰腺癌引發(fā)長(zhǎng)期疼痛的可能機(jī)制?？傊狙芯客ㄟ^對(duì)胰腺腫瘤疼痛患者胰蛋白酶水平進(jìn)行測(cè)定，發(fā)此刻胰腺癌組織中胰蛋白酶及其mRNA的水平增高，可激活PAR-2,可能通過PKC、ERK等通路，介導(dǎo)疼痛的發(fā)生。【參考文獻(xiàn)】［1］王麗，楊攻煥，李輝，等.1991—2000年中國(guó)胰腺癌病死率的變遷［J］.中華內(nèi)科雜志，2005,44:509-513.HoogerwerfWA,ShenoyM,WinstonJH,etal.Trypsinmediatesnociceptionviatheproteinase-activatedreceptor2:apotentiallynovelroleinpancreaticpain[J].Gastroenterology,2004,127:883-891.王成鋒，趙平重.胰腺癌的預(yù)防和初期診斷[J].國(guó)際外科學(xué)雜志，2007,34(9):584-587.KayssiA,AmadesiS,BautistaF,etal.Mechanismsofprotease-activatedreceptor2-evokedhyperexcitabilityofnociceptiveneuronsinnervatingthemousecolon[J].Physiol,2007,580:977-991.竇勇鷹，謝立群,李俊美，等.蛋白酶激活受體的研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志，2006,14(12):1206-1209.EthierC,LabelleY,PoiriercelldeaththroughinhibitionoftheMEK/ERKpathwayinMNNG-treatedHeLacells[J].Apoptosis,2007,12(11):2037-2049.RitchieE,SakaM,MackenzieC,etupregulationofproteinase-activated-receptors2and4expressionmediatedbyp38MAPkinaseandinhib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