流式的工作原理

第1章儀器構造和原理流式細胞技術是一種定量分析技術。定量測量在細胞生物學中之因此重要，是由于要想鑒別出一種細胞群體，重要是根據(jù)細胞特殊標識物的數(shù)量，而不僅是根據(jù)標識物的存在與否。多參數(shù)有關分析可以對細胞固有的性質(zhì)，例如光散射的測量與定量測定細胞的特性如表面受體、和DNA同步進行。當然，必要時還可同步再測定胞漿內(nèi)抗原、核內(nèi)抗原等等。這樣，就有也許從一種復雜的細胞混合體中，識別出某一種特定的細胞亞群。由于只有對大量的細胞進行測量才能發(fā)現(xiàn)稀有的亞群并把它分選出來，因此迅速測量是必需的。這里所謂分選即流式細胞分選術，是根據(jù)所測定的多種細胞性質(zhì)的不一樣組合，從細胞群體中將某個亞群分選出來，以對它進行功能研究、形態(tài)學研究、深入培養(yǎng)或做其他的分析。我司是生產(chǎn)流式細胞儀的重要廠家，我們生產(chǎn)了一系列臺式和落地型的流式細胞儀，并研發(fā)生產(chǎn)了FCM所用的多種單克隆抗體和熒光試劑。臺式機（FACScan、FACSort、FACSCalibur等）易于操作，穩(wěn)定性好，分析速度快，適合在臨床試驗室中應用。落地型機器(如FACSAria、FACSVantageSE、FACSVantageDiva等)具有迅速分選功能，功能齊全，分析靈活，適合基礎科學與生物醫(yī)學研究。我們本次重要簡介臺式機的構造及其工作原理。2.1流式細胞儀的工作原理流式細胞儀一般都包括液流系統(tǒng)、光學系統(tǒng)和電子系統(tǒng)，某些機型還可選配分選系統(tǒng)。待測樣本中的細胞經(jīng)液流系統(tǒng)傳送依序地通過流式細胞儀中激光照射的區(qū)域，細胞受激光的激發(fā)產(chǎn)生信號，被信號接受器接受并放大，這些放大了的信號經(jīng)計算機分析處理，并以圖表的形式直觀地顯示出來；通過度選系統(tǒng)還可以將某些類型的細胞群體篩選出來。流式細胞儀產(chǎn)生并分析的信號重要有光散射信號和熒光信號。光散射信號的強弱可以反應細胞的大小、形態(tài)及胞漿顆粒化的程度等。依熒光素的不一樣，用不一樣波長的光激發(fā)，發(fā)射出不一樣波長的熒光，可顯示不一樣的顏色，在不一樣的試驗體系中，這些熒光信號就可以反應不一樣的細胞生物學特性。將待測細胞染色后制成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞的平衡緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就可以包繞著樣品高速流動，構成一種圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過激光照射區(qū)(液柱與入射的激光束垂直相交點稱為檢測區(qū))，被熒光染色的細胞受強烈的激光照射后發(fā)出各色熒光，同步產(chǎn)生光散射。熒光信號由與激光束垂直的90度方向通過光學系統(tǒng)（透鏡、光欄、濾片和光檢測器等）搜集。熒光和側向角散射光檢測器是光電倍增管，前向角散射光檢測器是光電二極管。在前向小角（2-10度）進行檢測的散射光信號稱為“前向角散射光”。這種光散射信號反應了細胞的體積。細胞發(fā)出的熒光信號和光散射信號同步被90度角方向的熒光光電倍增管和前向光電二極管接受，被放大積分后轉(zhuǎn)換為電子信號輸入多道（1024道）脈沖高度分析儀，并在計算機屏幕上，以一維直方圖、二維位圖、或三維圖形顯示出來。或?qū)D形和數(shù)據(jù)直接輸入聯(lián)機專用的計算機，或存入磁盤以備分析。計算機迅速而精確地將所測數(shù)據(jù)計算出來，結合多參數(shù)分析，從而實現(xiàn)了細胞定量分析。2.2液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)的重要功能是將細胞依序送到測量區(qū)（流動室）接受檢測。2.2.1流動室（FlowCell）臺式機多采用密閉式液流系統(tǒng)，因此液流壓力與鞘液流流速皆為原廠預設，需要人為調(diào)整，故而操作簡樸。加上儀器內(nèi)之激光光路亦為原廠預先調(diào)設，因此較合用于臨床檢查與基礎科研。流動室(FlowCell)是儀器關鍵部件，由石英玻璃制成，被測樣品在此與激光相交。這種流動室的光學特性良好，流速較慢，因而細胞受照時間長，可搜集的細胞信號光通量大，配上廣角搜集透鏡，可獲得很高的檢測敏捷度和測量精度。流動室是樣品與鞘液互相混合的小室（參見圖例）。流動室內(nèi)充斥鞘液，樣品試管中的細胞被一高于整個液流系統(tǒng)的壓力推入流動室中，與鞘液相混后，經(jīng)由流動室中心之微細水路向上游動，鞘液則在此時包被水路，并藉由流體原理，使細胞能以單一細胞之形態(tài)，逐一流經(jīng)最窄的水路抵達測量區(qū)，而與激光光交會。常使用的鞘液流為等張溶液如phosphate-bufferedsaline，若配合特殊試驗可改用無菌的細胞培養(yǎng)液。2.2.2控制樣品的流速試驗樣品的檢測速度可以通過變化樣品試管中的壓力來控制，儀器面板中有三種預設樣品的流速；高速為每分鐘60微升，中速為每分鐘36微升，低速為每分鐘12微升。變化樣品的檢測速度會影響細胞向上游動的水路的直徑大小，同步影響試驗數(shù)據(jù)的變異系數(shù)。高速時水路的直徑大，受測細胞可偏離水路中軸，或左或右移動而增長變異系數(shù)。這一現(xiàn)象在某些規(guī)定低變異數(shù)的試驗中，需要防止，如做DNA分析時流速必須較低，控制在每秒兩百個細胞左右可到達較佳的成果；一般做淋巴細胞表面抗原分析時則無流速限制，可以高達每秒上千個細胞，而無損儀器辨識力。2.3光學系統(tǒng)儀器中具有一系列光學元件，包括激發(fā)光源、透鏡、光柵和濾片等，它們的重要功能是產(chǎn)生并搜集熒光、光散射等信號。2.3.1激光器激光基本沿著直線傳播，發(fā)散角小，很輕易聚焦到與細胞同一數(shù)量級。激光的亮度高，即在單位面積、單位立體角內(nèi)輸出功率尤其大。激光還具有良好的單色性，這些特點使激光成為細胞儀光源的首選。FACSCalibur基本配有一支波長488nm的氬離子激光器。氬離子激光器也是目前最常被使用在流式細胞儀中的光源。FACSCalibur可選配第二根氣冷式激光器，產(chǎn)生之635nm波長之紅色光束，配合APC、TOTO-3、TO-PRO-3等紅光激發(fā)染料的使用（見表一），可應用于四色熒光之分析。用雙激光光源的儀器擴大了其辨別的標識信號范圍和種類。2.3.3濾片流式細胞儀中所用的濾片有諸多種，有帶通濾片、長通濾片、短通濾片等。長波通濾片只容許某一波長以上的光線通過而將此波長如下的光線濾掉，如650nm長波通濾片只容許PerCP發(fā)射的紅色熒光通過，而488nm的激發(fā)光及FITC發(fā)射的525nm綠光所有被阻。帶通濾片的應用則恰好相反，它只容許某一特定波長的光線通過，例如一530nm帶通濾片只容許FITC發(fā)射的530nm綠色熒光通過，而其他波長的熒光所有被阻斷。FACSCalibur基本配置有(1)帶通濾片：488/10,530/30,585/42Bandpass（四色機型：661/16）。(2)長通濾片：650Longpass(四色機型：670LP)。(3)長波通二色性反射鏡：DM640LongPass。(4)短波通二色性反射鏡：DM560ShortPass。同步，測定側方散射光時，加用雙向分色濾片（Dichromic90/10beamsplitter）。圖示FACSCalibur流式細胞儀中濾片的基本設置。

2.4電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)重要有三個功能：(1)將光學信號轉(zhuǎn)換成電子信號。(2)分析所輸出的電流信號，以脈沖高度、寬度、積分面積顯示。(3)量化信號并傳至計算機。2.4.1光電探測器（Photodetectors）：光電探測器的用途是將光學信號轉(zhuǎn)換成電子信號。FACSCalibur細胞儀使用兩類探測器：硅晶光電二極管及光電倍增管（PMT）。光電二極管與光電倍增管各有其長處，光電倍增管在光線較弱時有很好的穩(wěn)定性，而當光線很強時光電二極管就比光電倍增管穩(wěn)定，因此FACSCalibur在探測FSC時用光電二極管；在探測熒光與SSC時，由于光信號較FSC弱得多，因此探測器敏捷度是重要原因，必須使用光電倍增管。光電倍增管接受外來的光子信號并釋出光電子，運用磁場將光子撞擊到倍增電極上釋出電子，再撞擊到下一種倍增電極產(chǎn)生更多的電子，通過這一連串的撞擊能放大并產(chǎn)生相稱多的電子，最終再以陽極搜集最終所有的電子，并產(chǎn)生輸出電流信號。使用光電倍增管的長處除了可提高光信號之外，真正信號與噪聲之比值也較高。2.4.2信號的產(chǎn)生及處理光電二極管及光電倍增管所輸出的電流信號，經(jīng)由初步放大器（pre-amplifier）轉(zhuǎn)換成電壓，再經(jīng)由主波放大器（mainpulseamplifier）將所需之信號放大與處理（參見圖）。信號的放大可以使用線性（linear）或?qū)?shù)（logarithmic）兩種型態(tài)，一般前向及側向角散射光光的信號使用線狀放大，由于散射光變異范圍較??；而由于熒光信號變異范圍較大，因此多使用對數(shù)放大，唯一例外的是DNA分析時是使用線性放大，由于但愿維持熒光信號與DNA含量的正比關系。2.5散射光的測量在流式細胞儀中，從光的散射信號可以得到非常有價值的數(shù)據(jù)，由于細胞對光的散射是細胞在未遭受任何破壞狀況下固有的特性，因此可以用散射光的信號對未染色的活細胞進行分析。細胞在液流中通過測量區(qū)時，經(jīng)激光照射，細胞向空間360度角的所有方向發(fā)射光線，散射的信號與細胞的大小、形狀、質(zhì)膜、和細胞內(nèi)部的折射率有關。在流式細胞術中常用的有前向角散射光（FSC）和側向角散射光（SSC），前者亦稱0度角散射，后者亦稱90度角散射。2.5.1前向角散射光（FSC）前向角散射光亦稱小角散射或0度角散射。一般我們僅能說前向角散射光的強度與細胞的大小有關。對同一種細胞群體，散射光強的，其細胞大某些；而散射光弱的，其細胞小某些。究竟更精確的關系是什么，因細胞不一樣、處理措施不一樣、固定措施不一樣，以致我們無法講出更精確的結論。甚至當細胞是非球形的如雞紅血球、扁平狀的精子時，由于細胞在液流中空間取向的不一樣，也可導致對同型細胞測得的前向角散射光信號完全不一樣，這是必須注意的。2.5.2側向角散射光（SSC）側向角散射光亦稱90度角散射或大角散射，搜集到的是細胞通過測量區(qū)時側方向的散射光。側向角散射光的強度與有關細胞內(nèi)部的精細構造和顆粒性質(zhì)有關。當然，側向角散射光光也與細胞形狀、大小有關，但這不屬于側向角散射光獲取數(shù)據(jù)的重要方面。以上所有的散射光與入射光波長一致，這是散射光與熒光的最大不一樣之點。散射光的探測器可以是硅光二極管，也可以是光電倍增管，前者多用于探測前向角散射光，后者用于探測側向角散射光光。在實際使用中，儀器首先是對光散射信號進行測量。由于通過測量區(qū)的每個細胞不管它與否已被染色都能散射光線，因此光散射分析與熒光探針聯(lián)合使用時，可鑒別出樣品中被染色的細胞和未染色的細胞，光散射測量最有效的用途，是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。用前向角散射和側向角散射光雙參數(shù)測定，可從不加任何染料的小鼠全骨髓中鑒別出若干個亞群。舉例而言，流式細胞儀可根據(jù)光散射信號將人白細胞提成三個亞群，淋巴細胞，單核細胞與粒細胞：淋巴細胞FSC與SSC都小，單核細胞FSC大與SSC中等，而粒細胞FSC與SSC都大。2.5.3電壓閥值的設定由于流式細胞儀的高敏感度，只要溶液中稍有雜質(zhì)就很輕易產(chǎn)生一微小電壓信號，因此必須設定電壓閥值（thresholdvoltage），所有進入的信號必須高于此閥值才被接受為信號，操作者一般對前向角散射光設定閥值，來排除雜質(zhì)或細胞碎片或體積變小的死細胞。2.5.4線性測量和對數(shù)測量的選擇散射光測量時一般使用線性放大器，即放大器的輸出與輸入是線性關系，輸入增大1倍，輸出也增大1倍。線性放大器合用在較小范圍內(nèi)變化的信號以及代表生物學線性過程的信號。前向角散射光和DNA測量即屬于這一類。但測量中有時需要用對數(shù)放大器，它的輸出與輸入是對數(shù)關系。假如本來輸出為l，當輸入增大到本來的10倍時，輸出是2；當輸入又增大10倍時，輸出為3，等等。如側向角散射光光由于信號大小變化范圍較大，有時用對數(shù)放大器也許好某些。2.6熒光測量當一種物體受到光能激發(fā)后，物體中的電子到達高的能階（激發(fā)狀態(tài)），當它答復到原有的狀態(tài)時，多出的能量就以光的形式輻射出來。這就是說當一種物體吸取了紫外光或者短波光的能量，它能發(fā)射出比本來吸取的波長更長的光的特性，這種現(xiàn)象稱為〝熒光〞。2.6.1熒光測量的意義熒光信號可以反應不一樣的細胞生物學特性。如用熒光染料標識的單克隆抗體特異性地與細胞表面的抗原、受體或膜糖蛋白結合，在激光的激發(fā)之下，發(fā)出一定波長的熒光。熒光信號的強度反應了膜抗原、受體或糖蛋白的相對數(shù)量，對熒光信號進行搜集分析，就可以實現(xiàn)對細胞亞群和功能等的分析。用DNA染料對DNA進行染色，染料通過一定方式與DNA鏈接合，在激光的激發(fā)下，染料發(fā)出熒光，測定熒光的強度，就可得出相對DNA的含量，進而可對細胞周期時相進行分析。用特定的熒光染料還可對細胞鈣離子濃度、細胞內(nèi)pH值以及細胞膜電位等進行測定。2.6.2熒光染料的選擇選擇熒光染料的根據(jù)就是要理解儀器的光源系統(tǒng)，同步考慮染料的激發(fā)光譜。激發(fā)光波長應盡量靠近熒光染料的激發(fā)光譜峰值。2.6.3探測器的選擇儀器在同步檢測多種熒光時，每個熒光檢測器只容許一種指定波長的熒光信號進入而被檢測，因此使用者必須選用合適的熒光信號接受器，才能收到最佳的信號。選擇檢測器的根據(jù)就是要理解熒光染料的發(fā)射光譜。以三色FACSCalibur為例，假如熒光光譜峰值落在綠色范圍（515-545nm波長），選用第一熒光檢測器；假如光譜峰值落在橙紅色范圍（564-606nm），選用第二熒光檢測器；假如熒光光譜峰值落在深紅色范圍（>650nm），選用第三熒光檢測器。

表一、常用熒光染料之光學特性測量參數(shù)熒光染料吸光波長(nm)熒光波長(nm)標示抗體用染劑Fluorescein,FITC490520Phycoerythrin-R480578Peridinin-chlorophyll,PerCP490677PerCP-Cy5.5490680Cy-Chrome495670PE-Cyanine5480670Allophycocyanine,APC650660APC-Cy7650770核酸含量分析EthidiumBromide510595PropidiumIodide536617AcridineOrange480(+DNA)450(+RNA)520650ThiazoleOrange509533細胞存活率PropidiumIodide5366177-AminoActinomycinD545647YOYO-1,YO-PRO-1491509EthidiumMonoazide493620TOTO-3,TO-PRO-3642661報導基因GFPS65A,S65C475506GFPS65L,S65T486510細胞膜電位DiO-C6(3)485525粒腺體膜電位Rhodamine123485546細胞內(nèi)pH值BCECF-AM488Ratio520/620SNARF1-AM514Ratio587/640細胞內(nèi)鈣濃度Fluo3-AM506528CalciumGreen-1488530FuraRed488660H2O2sensitiveDihydrorhodamine123505534DCFH-DA505535O2-radicalsensitiveHydroethidine518605EsterasesensitiveFluorescein-DA4955252.6.4線性測量和對數(shù)測量的選擇熒光測量常使用對數(shù)放大器。由于在免疫學的一種樣品中、也許有的細胞未被染色僅有自發(fā)熒光，為陰性群體；被染上色的細胞特異性熒光也許比自發(fā)熒光強數(shù)倍到數(shù)十倍，是為陽性群體；有時還會有某些被染色的細胞，其熒光比自發(fā)熒光強數(shù)百倍。是為強陽性群體、對同步具有以上