d5-酶學(xué)基礎(chǔ)蛋白質(zhì)工程-PPT幻燈片

酶工程的概念從應(yīng)用目的出發(fā)研究酶，在一定的生物反應(yīng)裝置中利用酶的催化性質(zhì)，將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用的物質(zhì)。是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透結(jié)合形成的一門新的技術(shù)科學(xué)，是酶學(xué)、微生物學(xué)的基本原理與化學(xué)工程有機(jī)結(jié)合而產(chǎn)生的邊緣科學(xué)培養(yǎng)室1920年，過(guò)氧化物酶高度純化，酶活性很高，但是檢測(cè)不到蛋白質(zhì)，認(rèn)為酶不是蛋白質(zhì)？由于檢測(cè)技術(shù)落后。1926年，美國(guó)的Sumner從刀豆中得到脲酶結(jié)晶，證明酶具有蛋白質(zhì)性質(zhì)（1947年諾貝爾獎(jiǎng)）1960年，提出操縱子學(xué)說(shuō)，酶生物合成的基本調(diào)節(jié)機(jī)制1969日本固定化氨基?；?，第一次將固定化酶成功地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)?！腹こ陶Q生1970美國(guó)的Smith發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶（1979年諾貝爾獎(jiǎng)）1982年，RNA自我剪接功能（self-splicing），核酸類酶（ribozyme）改變了酶的傳統(tǒng)概念酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白質(zhì)或RNA）蛋白類酶（P酶）核酸類酶（R酶）蛋白類酶的分類：1．氧化還原酶2．轉(zhuǎn)移酶3．水解酶4．裂合酶5．異構(gòu)酶6．連接酶（合成酶）1．氧化還原酶(Oxidoreductase)包括脫氫酶(Dehydrogenase)、氧化酶(Oxidase)、過(guò)氧化物酶、氧合酶、細(xì)胞色素氧化酶等2．轉(zhuǎn)移酶(Transferase)包括酮醛基轉(zhuǎn)移酶、?；D(zhuǎn)移酶、糖苷基轉(zhuǎn)移酶、含氮基轉(zhuǎn)移酶等3．水解酶(Hydrolase)脂肪酶、糖苷酶、肽酶等，水解酶一般不需輔酶4．裂合酶(Lyase)這類酶可脫去底物上某一基團(tuán)留下雙鍵，或可相反地在雙鍵處加入某一基團(tuán)。5．異構(gòu)酶(Isomerase)此類酶為生物代謝需要對(duì)某些物質(zhì)進(jìn)行分子異構(gòu)化，分別進(jìn)行外消旋、差向異構(gòu)、順?lè)串悩?gòu)等6．連接酶（合成酶）(LigaseorSynthetase)這類酶關(guān)系很多生命物質(zhì)的合成，其特點(diǎn)是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作為結(jié)合能源，有的還需金屬離子輔助因子。分別形成C-O鍵（與蛋白質(zhì)合成有關(guān)）、C-S鍵（與脂肪酸合成有關(guān)）、C-C鍵和磷酸酯鍵。

核酸類酶的命名分子內(nèi)催化（incis）的R酶分子間催化（intrans）的R酶7.核酸酶（催化核酸）Ribozyme核酸酶是一類特殊的RNA，能夠催化RNA分子中的磷酸酯鍵的水解及其逆反應(yīng)。二、酶的催化共性

酶參與生物化學(xué)反應(yīng)，它能降低反應(yīng)的活化能（分子參與化學(xué)反應(yīng)時(shí)所需要的最低能量），加快生化反應(yīng)的速率，酶在反應(yīng)過(guò)程中，其主體結(jié)構(gòu)和離子價(jià)態(tài)可以發(fā)生某種變化，但在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，一般酶本身不消耗，并恢復(fù)到原來(lái)狀態(tài)。

專一性強(qiáng)酶催化反應(yīng)有很高的選擇性，一種酶僅能作用于一種物質(zhì)或一類結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)進(jìn)行某一種反應(yīng)，這種特性稱為酶的專一性或選擇性。絕對(duì)專一性：一種酶只能催化一種化合物進(jìn)行一種反應(yīng)，天冬氨酸裂合酶相對(duì)專一性：一種酶能夠催化一類具有相同化學(xué)鍵或基團(tuán)的物質(zhì)進(jìn)行某種類型的反應(yīng)

鍵專一性：酯酶基團(tuán)專一性：胰蛋白酶反應(yīng)專一性：一種酶只能催化某化合物在熱力學(xué)上可能進(jìn)行的許多反應(yīng)中的一種反應(yīng)

底物專一性：一種酶只能催化一種底物

立體專一性：一種酶只能作用于所有立體異構(gòu)體中的一種效率高酶催化的轉(zhuǎn)換數(shù)每個(gè)酶分子每分鐘催化底物轉(zhuǎn)化的摩爾數(shù)一般103min-1，碳酸酐酶高達(dá)3.6x107min-1。使反應(yīng)活化能顯著降低作用條件溫和一般酶作用條件：常溫、常壓、pH值近中性特殊酶耐酸酶：胃蛋白酶pH=2-3耐熱酶：Taq酶95C耐凍酶：極地微生物優(yōu)點(diǎn)：專一性強(qiáng)、催化效率高、作用條件溫和缺點(diǎn)：穩(wěn)定性差、抗原性、游離酶只能一次性使用酶的特性改良：發(fā)現(xiàn)自然界的新酶、酶分子修飾、固定化A---BA+B+KAB+KEa,0E2AK+BA---B---KA---KE1E3Ea反應(yīng)進(jìn)程能量催化劑作用機(jī)理A+BABKA+KAKAK+BAB+Kk2k1k-1酶催化反應(yīng)歷程

Michaelis-Menten,Briggs,Haldane,Henry等人研究了酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，并提出了酶促反應(yīng)的歷程如下：

他們認(rèn)為酶(E)與底物(S)先形成中間化合物ES,中間化合物再進(jìn)一步分解為產(chǎn)物(P)，并釋放出酶(E)，整個(gè)反應(yīng)的速控步是第二步。對(duì)酶催化反應(yīng)過(guò)程的機(jī)理，得到大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持的是活性中間復(fù)合物學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為酶催化反應(yīng)至少包括兩步，首先是底物S和酶E相結(jié)合形成中間復(fù)合物[ES]，然后該復(fù)合物分解成產(chǎn)物P，并釋放出酶E。

例如：酶反應(yīng)

其反應(yīng)機(jī)理可表示為根據(jù)化學(xué)動(dòng)力學(xué)，反應(yīng)速率通常以單位時(shí)間、單位反應(yīng)體系中某一組分的變量來(lái)表示。對(duì)均相酶的催化反應(yīng)，單位反應(yīng)體系常用單位體積表示。反應(yīng)的速率可表示為

rs：底物S的消耗速率（mol/L﹒s）rp：產(chǎn)物P生成速率（mol/L﹒s）v：反應(yīng)體系的體積（L）

ns、np：底物S和產(chǎn)物P的質(zhì)量（mol）t：時(shí)間（s）

根據(jù)質(zhì)量作用定律，P的生成速率可表示為：

速率控制步驟在反應(yīng)動(dòng)力學(xué)中是一個(gè)重要的概念。在一個(gè)多步驟的反應(yīng)體系中，其中反應(yīng)速率最慢的一步稱為速率的控制步驟，并且控制步驟的速率決定了該反應(yīng)的速率。

“擬穩(wěn)態(tài)”假設(shè)。認(rèn)為由于反應(yīng)體系中底物濃度要比酶的濃度高得多，中間復(fù)合物分解時(shí)所得到的酶又立即與底物相結(jié)合，從而使反應(yīng)體系中復(fù)合物的濃度維持不變，即中間復(fù)合物的濃度不再隨時(shí)間而變化。

用穩(wěn)態(tài)近似法處理酶催化反應(yīng)的速率方程

令酶的原始濃度為[E]0，反應(yīng)達(dá)穩(wěn)態(tài)后，一部分變?yōu)橹虚g化合物[ES]，余下的濃度為[E]米氏常數(shù)KM當(dāng)反應(yīng)速率達(dá)到最大值rm的一半時(shí)，KM=[S]。0.20.40.60.81.0Vm0.0123456789101112131415[S]酶促反應(yīng)速率與底物濃度的關(guān)系1/2VmKmkm值是酶的特性常數(shù)，代表反應(yīng)速率為最大反應(yīng)速率一半時(shí)的基質(zhì)濃度，其單位為濃度單位。它和酶的濃度無(wú)關(guān)，但和溫度、pH等因素有關(guān)。根據(jù)km值可以推斷酶和底物的親和力。如果酶的專一性不高，可催化幾種底物發(fā)生反應(yīng)時(shí)，km值最小的就表示酶與這一底物的親和力最大，反之，則最小。酶催化的反應(yīng)級(jí)數(shù)的討論1.當(dāng)?shù)孜餄舛群艽髸r(shí)，[S]>>KM，r=k2[E]0，反應(yīng)只與酶的濃度有關(guān)，而與底物濃度無(wú)關(guān)，對(duì)底物濃度[S]呈零級(jí)。2.當(dāng)[S]<<KM時(shí)，r=k2[E]0[S]/KM

對(duì)[S]呈一級(jí)。3.當(dāng)[S]→∞時(shí)，r=rm=k2[E]0。雙倒數(shù)圖解法求方程參數(shù)下面的數(shù)學(xué)處理可以求出KM和rm重排得：以作圖，從斜率和截距求出KM和rm雙倒數(shù)圖解法（LineweaverBurk圖解）

將M—M方程取其倒數(shù)得到下式:以值對(duì)應(yīng)于作圖：

雙倒數(shù)法應(yīng)用廣泛，但有兩個(gè)缺點(diǎn)：1、選用基質(zhì)濃度不宜等量增加，否則在作圖時(shí)，點(diǎn)都會(huì)集中在縱軸附近，難于正確作圖?；|(zhì)濃度以選用1.0、1.11、1.25、1.43、1.67、2.0、2.5、3.33，5和10等為宜，這樣倒數(shù)值幾乎是等量遞增的。2、反應(yīng)速率測(cè)定稍有誤差，其倒數(shù)值誤差必將擴(kuò)大，特別是在低濃度基質(zhì)測(cè)定時(shí)，引起的誤差更大，這樣將影響直線斜率，影響rmax及Km值

的測(cè)定。影響酶催化作用的因素底物濃度的影響酶濃度的影響在底物濃度較低的條件下溫度的影響pH值的影響抑制劑的影響酶抑制劑：無(wú)機(jī)離子、小分子有機(jī)物、蛋白質(zhì)等可逆性抑制劑競(jìng)爭(zhēng)抑制非競(jìng)爭(zhēng)抑制反競(jìng)爭(zhēng)抑制不可逆抑制劑競(jìng)爭(zhēng)性抑制若在反應(yīng)體系中存在有與底物結(jié)構(gòu)相類似的物質(zhì)，該物質(zhì)也能在酶的活性部位上結(jié)合，從而阻礙了酶與底物的結(jié)合，使酶催化底物的反應(yīng)速率下降。這種抑制稱為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，該物質(zhì)稱為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。

競(jìng)爭(zhēng)性抑制主要特點(diǎn)抑制劑與底物競(jìng)爭(zhēng)酶的活性部位，當(dāng)抑制劑與酶的活性部位結(jié)合之后，底物就不能再與酶結(jié)合，反之亦然。在琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸為延胡索酸時(shí)，丙二酸是其競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。

抑制劑和底物競(jìng)爭(zhēng)與酶分子結(jié)合抑制劑與底物結(jié)構(gòu)相似隨著底物濃度增加，抑制作用減弱最大反應(yīng)速度不變，Km增大競(jìng)爭(zhēng)性抑制圖又競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑時(shí)，同樣底物濃度下，反應(yīng)速率減小。Km增大，達(dá)到同樣速率需多消耗底物。一部分酶活性位點(diǎn)被競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑占據(jù)，不能使底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。非競(jìng)爭(zhēng)抑制若抑制劑可以在酶的活性部位以外與酶相結(jié)合，并且這種結(jié)合與底物的結(jié)合沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，這種抑制稱為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。此時(shí)抑制劑既可與游離的酶相結(jié)合，也可以與復(fù)合物ES相結(jié)合，生成了底物—酶—抑制劑的復(fù)合物SEI。絕大多數(shù)的情況是復(fù)合物SEI為一無(wú)催化活性的端點(diǎn)復(fù)合物，不能分解為產(chǎn)物，即使增大底物的濃度也不能解除抑制劑的影響。還有一種是三元復(fù)合物SEI也能分解為產(chǎn)物，但對(duì)酶的催化反應(yīng)速率仍然產(chǎn)生了抑制作用。如核苷對(duì)霉菌酸性磷酸酯酶的抑制屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。非競(jìng)爭(zhēng)抑制圖非競(jìng)爭(zhēng)抑制使反應(yīng)速率降低，Km不變非競(jìng)爭(zhēng)性抑制與競(jìng)爭(zhēng)性抑制的

主要不同點(diǎn)對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制，隨著底物濃度的增大，抑制劑的影響可減弱；而對(duì)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，即使增大底物濃度也不能減弱抑制劑的影響。反競(jìng)爭(zhēng)抑制反競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特點(diǎn)是抑制劑不能直接與游離酶相結(jié)合，而只能與復(fù)合物ES相結(jié)合生成SEI復(fù)合物。反競(jìng)爭(zhēng)抑制圖反競(jìng)爭(zhēng)性抑制使反應(yīng)速率減小，Km減小例：水楊酸抑制谷氨酸脫氫酶催化的脫氫反應(yīng)。試根據(jù)下列實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定抑制類型Km和KI及值。又脫氫反應(yīng)速度r的單位是根據(jù)340nm波長(zhǎng)下光吸收速率的增加來(lái)表示的。谷氨酸脫氫酶的反應(yīng)結(jié)果谷氨酸，mmol

（含40mmol水楊酸）1.50.210.082.00.250.103.00.280.124.00.330.138.00.440.1616.00.400.18從圖中可以看出反應(yīng)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。酶用于生物催化的概況類別占總酶比例%利用率%水解酶hydrolases2665氧化還原酶oxidoreductases2725轉(zhuǎn)移酶transferases245裂合酶lyases12~5異構(gòu)酶isomerases5~1連接酶ligases6~1二．酶的組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1．單體酶2．寡聚酶3．多酶復(fù)合體3．多酶復(fù)合體的組成部分輔因子：酶蛋白中非蛋白質(zhì)部分，它可以是無(wú)機(jī)離子也可以是有機(jī)化合物。輔酶：有機(jī)輔因子與酶蛋白結(jié)合松散即為輔酶。輔基：有機(jī)輔因子與酶蛋白結(jié)合緊密即為輔基。三．酶的作用機(jī)制1．酶的作用過(guò)程2．酶與底物的結(jié)合模型3．酶的催化作用1．酶的作用過(guò)程酶的活性部位：是它結(jié)合底物和將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的區(qū)域，通常是整個(gè)酶分子相當(dāng)小的部分，它是由在線性多肽中可能相隔很遠(yuǎn)的氨基酸殘基形成的三維實(shí)體。2．酶與底物的結(jié)合模型a．鎖和鑰匙模型b．誘導(dǎo)鍥合模型a．鎖和鑰匙模型b．誘導(dǎo)鍥合模型酶抑制作用的概念和分類一概念二抑制程度的表示三抑制作用的分類四抑制作用的定義一概念：能降低酶催化反應(yīng)速度的因素1.失活作用2.抑制作用3.去激活作用4.阻遏作用1.失活作用失活作用是指由于一些物理因素和化學(xué)試劑部分或全部破壞了酶的三維結(jié)構(gòu)，即引起酶蛋白變性，導(dǎo)致部分或全部喪失活性。2.抑制作用抑制作用是指在酶不變性的情況下，由于必需基團(tuán)或活性中心化學(xué)性質(zhì)的改變而引起的酶活性的降低或喪失。3.去激活作用去激活作用，某些酶只有在金屬離子存在下才有活性，去除金屬離子也會(huì)引起這些酶活性的降低或喪失。4.阻遏作用阻遏作用指某些因素（如激素或藥物等）使細(xì)胞內(nèi)酶蛋白的合成減少，反應(yīng)速度的降低是由于酶分子數(shù)量的減少，每分子酶的催化效力并無(wú)變化.二．抑制程度的表示一般用反應(yīng)速度的變化來(lái)表示。若以不加抑制劑時(shí)的反應(yīng)速度為Vo，加入抑制劑后的反應(yīng)速度為Vi，則酶的抑制程度有下列幾種表示方法：二．抑制程度的表示1．相對(duì)活力分?jǐn)?shù)（殘余活力分?jǐn)?shù)）a=Vi/Vo2．相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)（殘余活力百分?jǐn)?shù)）a%==Vi/Vo*100%3．抑制分?jǐn)?shù)指被抑制而失去活力的分?jǐn)?shù)i=1-a=1-Vi/Vo4．抑制百分?jǐn)?shù)i%=(1-a)*100%==(1-Vi/Vo)*100%通常所謂抑制率是指抑制分?jǐn)?shù)或抑制百分?jǐn)?shù)。激活劑的影響常見(jiàn)的激活劑：多種二價(jià)金屬離子：Ca2+，Mg2+，Co2+，Zn2+，Mn2+Cl-等無(wú)機(jī)離子酶在激活劑的作用下，酶的催化活性提高，或者由酶原生成酶酶活力表示方法酶活力：在特定條件下，每1min能催化1umol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物時(shí)所需要的酶量，稱為一個(gè)酶活力單位，或稱為國(guó)際單位，用IU表示。酶活力還可用比活