開達(dá)膜原法、清熱涼血法對急性肺損傷小鼠nf-bp50表達(dá)的影響

開達(dá)膜原法、清熱涼血法對急性肺損傷小鼠nf-bp50表達(dá)的影響

急性肺損傷（ali）和急性呼吸急促綜合征（arsd）是指除心臟源以外的各種內(nèi)部和外部因素引起的急性和周期性缺如呼吸困難和嚴(yán)重感染、傷口和休克后的缺氧缺血性肺損傷綜合征。實(shí)質(zhì)是全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)在肺部的表現(xiàn)。急性肺損傷包括肺內(nèi)上皮和肺泡的損害。NF-κB的活化在SIRS的發(fā)生發(fā)展中起了重要的作用,各種創(chuàng)傷、毒性物質(zhì)、休克等誘因都能激活肺巨噬細(xì)胞和肺組織中的NF-κB,從而引起炎癥介質(zhì)的釋放增高,而出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征中肺部急性損傷。本實(shí)驗(yàn)研究通過采用小鼠尾靜脈注射LPS(10mg/kg)建立小鼠急性肺損傷動物模型,觀察模型對照組與開達(dá)膜原組、清熱解毒組及清熱涼血組核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κBp50)水平的變化情況,以探討中醫(yī)不同治法在干預(yù)急性肺損傷的機(jī)制。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動物清潔級昆明種雄性小鼠70只,體重(20±2)g,由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(動物合格證號:SCXK(滬)2003-0003)。1.3急性肺損傷模型建立清潔級昆明種雄性小鼠70只,體重(20±2)g。隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、開達(dá)膜原組、清熱解毒組、清熱涼血組5組,每組14只,再隨機(jī)分為8h、24h兩個亞組(每組7只)。模型對照組、清熱解毒組、清熱涼血組及開達(dá)膜原組經(jīng)尾靜脈注射LPS(10mg/kg)復(fù)制內(nèi)毒素性急性肺損傷模型,正常對照組注入等容積生理鹽水。開達(dá)膜原組、清熱解毒組、清熱涼血組于注射LPS(10mg/kg)后30min內(nèi)灌開達(dá)膜原方、清熱解毒方及清熱涼血方藥液各1次,各灌胃量按人與小鼠體表面積換算。正常對照組及模型對照組于相應(yīng)時間灌服等容積生理鹽水。注射LPS后8h(8h組),頸椎脫臼致死小鼠,開胸取出肺臟(稱重),置于10%的甲醛中固定,行免疫組化染色,封片,顯微鏡觀察。另一組注射LPS后24h(24h組),頸椎脫臼致死小鼠,開胸取出肺臟置于10%的福爾馬林液中,常規(guī)脫水、封蠟。1.4觀察指標(biāo)和測試方法1.4.2圖像分析檢測免疫組化ABC法。采用IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)醫(yī)學(xué)圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。每張切片在高倍鏡下隨機(jī)選擇不相重疊的3個視野,細(xì)胞核為藍(lán)色,NF-κBp50陽性細(xì)胞為棕黃色。計數(shù)視野中總細(xì)胞數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù),計算陽性細(xì)胞所占百分率。1.5系統(tǒng)處理方法實(shí)驗(yàn)所得計量數(shù)據(jù)以表示,統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS11.0軟件系統(tǒng)處理。各組組間進(jìn)行兩兩對比,先用方差齊性分析;若為方差齊性則用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),若為方差不齊,則用t檢驗(yàn)。P<0.05或P<0.01為差異有顯著性。2結(jié)果2.1小鼠肺體指數(shù)比較與正常對照組相比,造模后8h,模型對照組小鼠肺體指數(shù)明顯升高(P<0.05);與模型對照組相比,清熱解毒組小鼠肺體指數(shù)明顯降低(P<0.05)。見表1。2.2不同途徑感染nf-bp50表達(dá),正常對照組肺組織結(jié)構(gòu)正常,肺泡壁上偶見散在分布的NF-κBp50陽性細(xì)胞(見封三圖1)。模型對照組肺泡壁明顯增寬,可見炎癥細(xì)胞大量增生,肺泡壁和細(xì)支氣管壁散在分布大量NF-κBp50陽性細(xì)胞(見封三圖2)。清熱解毒方組可見局灶性病灶,肺泡壁和肺泡腔散在分布NF-κBp50陽性細(xì)胞(見封三圖3)。清熱涼血方組肺泡腔水腫明顯減輕,NF-κBp50陽性細(xì)胞散在分布于肺泡壁和肺泡腔(見封三圖4)。開達(dá)膜原方組炎癥細(xì)胞消退明顯,肺泡腔內(nèi)無水腫液,散在分布的NF-κBp50陽性細(xì)胞(見封三圖5)。與正常對照組相比,模型對照組NF-κBp50陽性細(xì)胞率升高(P<0.01),開達(dá)膜原方組、清熱解毒方組及清熱涼血方組NF-κBp50陽性細(xì)胞率均降低(P<0.05或P<0.01),各中藥組之間陽性細(xì)胞率無明顯差異。見表2。2.3小灶性肺出血灶模型光鏡觀察,正常對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁薄,肺泡內(nèi)未見水腫液,偶見肺間質(zhì)白細(xì)胞少量增加(見封三圖6);模型對照組肺組織呈大片出血、壞死,大量炎細(xì)胞浸潤(見封三圖7);清熱解毒組局部肺組織中仍見小出血灶,肺組織結(jié)構(gòu)未被破壞,局部細(xì)支氣管上皮細(xì)胞增生(輕度)(見封三圖8);清熱涼血組肺組織見一處小灶性肺出血灶(見封三圖9);開達(dá)膜原組見輕度肺間質(zhì)炎癥(見封三圖10)。3急性肺損傷和肺局部炎癥反應(yīng)近年來,盡管對危重醫(yī)學(xué)的研究取得了很大進(jìn)展,但ALI/ARDS的病死率仍然高達(dá)30%~50%。有研究認(rèn)為,糖皮質(zhì)激素、阿斯匹林、抗氧化劑、抗炎細(xì)胞因子、一氧化氮等治療急性肺損傷都有不同程度的抑制NF-κB的活化作用,但同時具有毒副反應(yīng)。因此,采用中醫(yī)不同治法干預(yù)急性肺損傷為臨床治療提示了一個新的思路。核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)是與B細(xì)胞免疫球蛋白的輕鏈基因增強(qiáng)子序列結(jié)合的核轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB存在于哺乳動物的所有細(xì)胞中,參與了感染、炎癥免疫反應(yīng)等病理過程。NF-κB活化還參與機(jī)體免疫和防御反應(yīng),及細(xì)胞周期調(diào)控與細(xì)胞分化的控制。正常細(xì)胞在靜息狀態(tài)下,NF-κB與其抑制因子相結(jié)合,并以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。在炎癥情況下,炎癥介質(zhì)中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可激活NF-κB,與細(xì)胞分裂有關(guān)的因素如抗原、植物血凝素、刀豆素A、細(xì)菌脂多糖、放射線等也可促進(jìn)NF-κB的活化。NF-κB的活化對急性肺損傷有著重要意義。NF-κB的持續(xù)活化是急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征高病死率的預(yù)兆。抑制NF-κB的活化可減輕炎癥反應(yīng),從而減輕急性肺損傷。王建春等研究表明,在脂多糖(LPS)復(fù)制的急性肺損傷模型中,大鼠肺組織中NF-κB被激活的同時,伴有TNF-αmRNA表達(dá)增高,且這些mRNA表達(dá)是受到NF-κB控制的。Schwart等發(fā)現(xiàn)ARDS患者的肺泡巨噬細(xì)胞的NF-κB激活水平明顯高于對照組?？梢?NF-κB的激活與急性肺損傷時肺局部炎癥免疫反應(yīng)密切相關(guān)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,急性肺損傷屬溫病中的危重證。常見癥狀是氣喘、呼吸急促、脈躁急。其病因與溫邪蘊(yùn)肺有關(guān)?！稖夭l辨》曰:“熱病已得汗,脈尚躁而喘,故知其復(fù)熱也;熱不為汗衰,火熱克金故喘。金受火克,肺之化源欲絕,故死?！逼浠从^既是呼吸衰竭的中醫(yī)機(jī)制,又是其癥狀的描述。吳鞠通在《溫病條辨》中又曰:“細(xì)按溫病死狀百端……在上焦有二,一曰肺之化源絕者死,二曰心神內(nèi)閉,內(nèi)閉外脫者死?！闭f明肺之化源絕是危重證。其病理機(jī)制與溫邪迫血、毒瘀互結(jié),肺氣膹郁有關(guān)?！稖夭l辨》又曰:“不得太息,氣郁之極也,”“溫邪逼迫血液上走清道,循清竅而出……實(shí)血與液交迫而出,有燎原之勢,化源速絕”,“化源絕,乃溫病第一死法也?！睔w納而言,中醫(yī)認(rèn)為其產(chǎn)生機(jī)制是溫邪上受,郁而化熱,熱毒傷陰,熱毒煎熬致瘀,毒瘀互結(jié);也可由濕熱內(nèi)蘊(yùn)化毒,熱入營血而致。根據(jù)中醫(yī)病機(jī),臨床分型多見邪熱化毒型、熱傷營血型、濕熱疫毒邪入膜原型等。治療多采用清熱解毒、清熱涼血、開達(dá)膜原等法?，F(xiàn)代藥理研究表明:清熱解毒方中黃芩能顯著改善內(nèi)毒素致大鼠DIC時血小板、纖維蛋白原的減少,還能影響花生四烯酸代謝,從而抑制內(nèi)毒素所致發(fā)熱反應(yīng)。清熱涼血方中赤芍藥具有抗血栓形成、抗血小板聚集、抗凝血、激活纖溶等作用,還具有顯著的抗病原微生物作用。開達(dá)膜原方中厚樸煎劑(1∶5至1∶320)的抗菌作用較黃連、黃芩及大黃都強(qiáng),且抗菌作用不因加熱而被破壞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與模型對照組比較,開達(dá)膜原組、清熱解毒組及清熱涼血組肺組織病理損傷均減輕,且各組肺組織NF-κBp50陽性細(xì)胞率均降低(P<0.05-0.01),提示開達(dá)膜原方、清熱解毒方及清熱涼血方對內(nèi)毒素致急性肺損傷有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與其調(diào)控NF-κBp50陽性細(xì)胞表達(dá)率有關(guān)。1.2成分分析LPS,購自美國Sigma公司(LPS:EscherichiacoliO55:B5,noL2880;批號:050307);NF-κBp50免疫組化試劑盒,購自美國SantaCruz公司[NF-κBp50(NLS):sc-114]。清熱解毒方由黃連、黃芩、黃柏、梔子等6味中藥按一定比例組成;清熱涼血方由