第六章 DNA的體外重組與轉(zhuǎn)移

外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞第六章DNA的體外重組與轉(zhuǎn)移重組DNA分子的構(gòu)建需要考慮三個(gè)因素（P155）（1）實(shí)驗(yàn)步驟要盡可能地簡單易行；（2）連接形成的“接點(diǎn)”序列，應(yīng)能被一定的核酸內(nèi)切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段；（3）外源基因必須在表達(dá)載體的啟動(dòng)子下，并置于正確的ORF中，以便目的基因的表達(dá)。第一節(jié)重組DNA分子的構(gòu)建一、粘性末端的連接DNA連接酶把相互靠近的5’端磷酸與3’-OH連到一起。優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)操作簡單，易于回收外源DNA片段缺點(diǎn)（P156）（1）不易定向克?。?）難插入特定的基因（3）大片段DNA的重組率低（4）載體易發(fā)生自身串聯(lián)（5）目的片段自身各拷貝之間可能自連1、一種限制性核酸內(nèi)切酶酶切的粘性末端間的連接ligasenick堿性磷酸酶的脫磷酸作用阻止線性的質(zhì)粒DNA分子再環(huán)化用識別序列完全不同的一對限制性酶同時(shí)消化一個(gè)特定的DNA分子，將會(huì)產(chǎn)生具有兩個(gè)不同粘性末端的DNA片段，并可使該片段按一定方向插入到載體分子上，當(dāng)然載體分子需用同一對限制性內(nèi)切酶處理。2、不同限制性核酸內(nèi)切酶酶切的粘性末端的連接另外，可應(yīng)用同尾酶（識別序列不同，但末端相同）連接。連接后，形成的重組子不被原來的酶識別切割，但有時(shí)可被第三種酶的識別切割?；厥胀裁傅倪B接對于兩個(gè)不能互補(bǔ)的粘性末端的連接，通常采用平頭末端的連接方式，即先將其處理成平頭末端，再連接，具有兩種情況。（1）5‘突出末端的補(bǔ)平：大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow大片段；（2）3’突出末端的切平：T4噬菌體DNA聚合酶或S1核酸酶。平頭末端連接的缺點(diǎn)：連接效率低、破壞原有的識別序列、雙向插入及多拷貝插入。二、平頭末端的連接1、直接連接T4DNA連接酶雖然能直接連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’1972年，斯坦福大學(xué)的P.Labban和P.Kaiser提出。同聚加尾法2、人工加尾形成“粘性末端”DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸。①原理：分別給載體和插入片段加上互補(bǔ)的核苷酸。②加尾—堿基互補(bǔ)④缺點(diǎn)：③優(yōu)點(diǎn)：不易自身環(huán)化、連接效率高、所有DNA片段均可用此法。非酶切位點(diǎn)操作繁鎖、外源片段難以回收、有可能影響外源基因的表達(dá)。用T4DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個(gè)人工粘性末端。（1）銜接物（linker）連接①linker用化學(xué)合成法合成的一段8-12bp的含有特定限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用3、人工接頭法

④缺點(diǎn)：a、可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能切下完整的插入片段，需進(jìn)行甲基化保護(hù)及去保護(hù)，該操作較繁瑣。b、能給載體連接上Polylinker:③優(yōu)點(diǎn)：（2）DNA接頭(adapter)連接法1978年康奈爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’BamHIadapter用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。①adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。②adapter的作用接頭與接頭會(huì)彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。③優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用。④缺點(diǎn)：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5’端的磷酸，防止自我連接。接頭連接在載體上以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。⑤防止自我連接Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’但接頭會(huì)自我連接接頭5‘P-GATCCCGG-OHHO-GGCC-P5’5’P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P-5’CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’接頭之間不能形成磷酸二酯鍵自我連接！5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’CIP處理-OHHO-接頭Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘GATCCCGG-HO-GGCCCCGG-OH-GGCCCTAG5’5’GATCCCGG-OH3’HO-GGCC5’切口切口HO--OHCIP處理T4ligase再用T4多核苷酸激酶處理后連接外源DNA，連接過程中此缺口也被連接三、PCR產(chǎn)物的連接1、在引物的5’端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)符合載體的多克隆位點(diǎn)；（1）設(shè)計(jì)原則（2）帶酶切位點(diǎn)的引物的結(jié)構(gòu)3’端15~20bp與模板互補(bǔ)；5’端6~10bp是某個(gè)內(nèi)切酶的識別序列。避免與所擴(kuò)增的DNA片段內(nèi)部酶切位點(diǎn)重復(fù)。引物1GCAGAATTC互補(bǔ)序列模板EcoRI位點(diǎn)5’--3’GCAGAATTC互補(bǔ)序列5’--3’3’模板GCAGAATTC互補(bǔ)序列PCR產(chǎn)物5’--3’3’復(fù)性延伸模板模板3’3’CCTAGGCGG互補(bǔ)序列模板BamHI位點(diǎn)-5’3-’5’復(fù)性延伸模板模板3’3’CCTAGGCGG互補(bǔ)序列-5’3’-模板5’CCTAGGCGGPCR產(chǎn)物互補(bǔ)序列5’3’引物2帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物GCAGAATTCPCR產(chǎn)物5’--3’CCTAGGCGGPCR產(chǎn)物-5’3’-CGTCTTAAGGGATCCGCCEcoRI位點(diǎn)BamHI位點(diǎn)AATTCPCR產(chǎn)物5’--3’CCTAGPCR產(chǎn)物-5’3’-GCEcoRIBamHI兩頭各有一個(gè)粘性末端！2、與T載體直接連接（1）PCR產(chǎn)物兩個(gè)3’端一般都有一個(gè)ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA雙鏈的3’端再加上一個(gè)多余的核苷酸（優(yōu)先加A）。（2）T載體的兩個(gè)3’端人為地各加一個(gè)T利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，當(dāng)原料中只有dTTP時(shí)，被迫在平端載體上添加T！AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA四、DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)1、插入片段與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。2、DNA插入的方向正確用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3、插入基因的開放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定向插入（2）起始密碼子尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼的時(shí)候，更要注意。ATGCGAATTC載體GGAGAATTC

ATGCAG…插入片段EcoRIEcoRIATGCGAATT

CATGCAG…重組但移碼突變！4、防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片段的用量連接反應(yīng)體系中，插入片段比載體多10倍以上。（2）用堿性磷酸酶處理載體載體切口的5’磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片段以單鏈連接。5’3’載體插入片段（3）用同聚物加尾法處理載體2.載體自身環(huán)化連接（能存活）3.載體之間互相連接（能存活）4.插入片段互相連接（不能存活）5.一個(gè)載體與幾個(gè)插入片段重組（能存活）五、載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果6.幾個(gè)載體與一個(gè)插入片段重組（能存活）1.一個(gè)載體與一個(gè)插入片段重組（能存活）受體細(xì)胞：能夠攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持、具有應(yīng)用價(jià)值和理論研究價(jià)值的細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞的種類可分為三類：*原核生物受體細(xì)胞*植物受體細(xì)胞*動(dòng)物受體細(xì)胞第二節(jié)重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞1、原核生物受體細(xì)胞特點(diǎn)：1）染色體裸露，便于外源DNA重組2）基因組簡單，便于進(jìn)行遺傳分析3）單細(xì)胞生物，易于獲得一致性受體細(xì)胞4）培養(yǎng)條件簡單，生長快，實(shí)驗(yàn)周期短主要的原核受體細(xì)胞：

大腸桿菌，枯草桿菌，藍(lán)細(xì)菌等應(yīng)用*構(gòu)建基因組文庫*表達(dá)基因產(chǎn)物*保存和擴(kuò)增目的基因2、植物受體細(xì)胞特點(diǎn)：1）具有體細(xì)胞全能性，一個(gè)分離的活細(xì)胞在合適的條件下可分化成植株2）具有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，可以纖維素酶處理獲得原生質(zhì)體.應(yīng)用：轉(zhuǎn)基因棉花，水稻，玉米，馬鈴薯，煙草3、動(dòng)物受體細(xì)胞特點(diǎn)1）體細(xì)胞一般無全能性，只能分化到細(xì)胞株2）生殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞等具有全能性，可分化、培養(yǎng)成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用轉(zhuǎn)基因羊，鼠，兔，豬，牛，檢測動(dòng)物核酸疫苗的表達(dá)等。一、重組體導(dǎo)入原核細(xì)胞（一）感受態(tài)大腸桿菌的制備處于能吸收外源DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞。2、目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。1、概念使用喪失了限制體系的大腸桿菌。3、菌種（以E.coli為例）在0℃的CaCl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹，Ca2+使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞膜的通透性。轉(zhuǎn)化時(shí)加入DNA后，Ca2+能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗DNA酶的羥基－磷酸鈣復(fù)合物，黏附在胞膜的外表面；42℃熱激處理，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生擾動(dòng)，出現(xiàn)間隙，即可使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。4、制備原