第八章 非線性色譜原理及其在蛋白質(zhì)分離與純化中的應(yīng)用

第八章非線性色譜原理及其在蛋白分離與純化中的應(yīng)用第一節(jié)概述色譜法起源于20世紀(jì)初，1906年俄國(guó)植物學(xué)家米哈伊爾·茨維特用碳酸鈣填充豎立的玻璃管，以石油醚洗脫植物色素的提取液，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間洗脫之后，植物色素在碳酸鈣柱中實(shí)現(xiàn)分離，由一條色帶分散為數(shù)條平行的色帶。由于這一實(shí)驗(yàn)將混合的植物色素分離為不同的色帶，因此茨維特將這種方法命名為Хроматография，這個(gè)單詞最終被英語(yǔ)等拼音語(yǔ)言接受，成為色譜法的名稱。漢語(yǔ)中的色譜也是對(duì)這個(gè)單詞的意譯。1952年馬丁和詹姆斯提出用氣體作為流動(dòng)相進(jìn)行色譜分離的想法，他們用硅藻土吸附的硅酮油作為固定相，用氮?dú)庾鳛榱鲃?dòng)相分離了若干種小分子量揮發(fā)性有機(jī)酸。

氣相色譜的出現(xiàn)使色譜技術(shù)從最初的定性分離手段進(jìn)一步演化為具有分離功能的定量測(cè)定手段，并且極大的刺激了色譜技術(shù)和理論的發(fā)展。相比于早期的液相色譜，以氣體為流動(dòng)相的色譜對(duì)設(shè)備的要求更高，這促進(jìn)了色譜技術(shù)的機(jī)械化、標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化；氣相色譜需要特殊和更靈敏的檢測(cè)裝置，這促進(jìn)了檢測(cè)器的開(kāi)發(fā)；而氣相色譜的標(biāo)準(zhǔn)化又使得色譜學(xué)理論得以形成色譜學(xué)理論中有著重要地位的塔板理論和VanDeemter方程，以及保留時(shí)間、保留指數(shù)、峰寬等概念都是在研究氣相色譜行為的過(guò)程中形成的。

60年代，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易汽化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。60年代末科克蘭、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人開(kāi)發(fā)了世界上第一臺(tái)高效液相色譜儀，開(kāi)啟了高效液相色譜的時(shí)代。高效液相色譜使用粒徑更細(xì)的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數(shù)，以高壓驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相，使得經(jīng)典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)月完成的分離工作得以在幾個(gè)小時(shí)甚至幾十分鐘內(nèi)完成。1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實(shí)踐》一書，標(biāo)志著高效液相色譜法（HPLC）正式建立。在此后的時(shí)間里，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測(cè)手段，在有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物開(kāi)發(fā)與檢測(cè)、化工、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、商檢和法檢等方面都有廣泛的應(yīng)用。高效液相色譜同時(shí)還極大的刺激了固定相材料、檢測(cè)技術(shù)、數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及色譜理論的發(fā)展。一、色譜法的基本特點(diǎn)1、分離效率高2、應(yīng)用范圍廣3、操作參數(shù)多4、高靈敏度在線檢測(cè)5、快速分離6、連續(xù)自動(dòng)化操作1、分離效率高每米可達(dá)十幾萬(wàn)個(gè)理論塔板，幾個(gè)厘米的色譜柱就可以分離多組分的蛋白質(zhì)混合物。2、應(yīng)用范圍廣從極性到非極性，離子型到非離子型，小分子到大分子，無(wú)極到有機(jī)及生活物資，以及其它熱穩(wěn)定或熱不穩(wěn)定的化合物，可以說(shuō)無(wú)所不包。尤其是對(duì)生物樣品的分離分析，是其他方法無(wú)法代替的。3、操作參數(shù)多流動(dòng)相可以是氣體、液體或超臨界流體。各種流體中又有不同的物質(zhì)可選用。固定相可用液、固兩大類，每類中又有許多種可供選擇。4、高靈敏度在線檢測(cè)與其他分離手段相比，色譜具有高靈敏度在線檢測(cè)的特性。有各種不同的檢測(cè)器，適合于多種千差萬(wàn)別的樣品需要。5、快速分離HPLC由于采用了高壓溶劑傳輸系統(tǒng)，即使采用高效細(xì)顆粒填料，也能保證分離過(guò)程在一定的線速下進(jìn)行，而且由于柱效提高，更加快了分離速度。6、連續(xù)自動(dòng)化操作電腦用于色譜分離過(guò)程以后，從最初的簡(jiǎn)單數(shù)據(jù)處理發(fā)展到目前作為控制操作的中心，使大量的樣品可以按事先設(shè)置的程序進(jìn)行完全自動(dòng)連續(xù)的操作。二、線性色譜與非線性色譜線性和非線性是數(shù)學(xué)函數(shù)的概念，表示自變量與應(yīng)變量之間的關(guān)系。在色譜學(xué)中，如果流動(dòng)相中樣品濃度Cm與固定相中樣品的濃度Cs之間呈線性關(guān)系，那么在這種情況下的色譜分配過(guò)程就是線性色譜，即：

Cs=KCmK為分配系數(shù)。Cm流動(dòng)相中樣品的濃度。Cs固定相中樣品的濃度規(guī)律如果Cs和Cm之間不存在線性關(guān)系，而是出現(xiàn)其他的函數(shù)關(guān)系，那么對(duì)應(yīng)的色譜分離過(guò)程就稱為非線性色譜。在實(shí)踐過(guò)程中得知，當(dāng)樣品濃度很低時(shí)，Cs和Cm之間往往保持線性關(guān)系。在高濃度時(shí)Cs和Cm之間往往不出現(xiàn)線性關(guān)系。非線性和線性色譜行為的根本不同表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面1、樣品的保留值可變。2、峰形不對(duì)稱。3、色譜峰的峰高與濃度不是線性關(guān)系第二節(jié)非線性色譜理論基礎(chǔ)非線性色譜理論是研究樣品在固定相與流動(dòng)相中的濃度處于非線性關(guān)系的狀態(tài)下，各種實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)色譜分離過(guò)程的影響，建立起柱參數(shù)、溶質(zhì)性質(zhì)及操作條件之間的定量關(guān)系式。由于此時(shí)Cs與Cm不呈線性關(guān)系，所以必須首先了解他們之間的函數(shù)關(guān)系，也既要研究吸附等溫線及相應(yīng)的吸附模型。一、吸附過(guò)程及吸附等溫線吸附指一種通常發(fā)生在兩相界面上的現(xiàn)象：處于界面上的分子或原子與其內(nèi)部的分子或原子具有不同的能量與性質(zhì)，產(chǎn)生了一種不平衡的傾向，造成界面的分子或原子數(shù)與內(nèi)部不同，這種差異就形成了吸附現(xiàn)象。吸附過(guò)程主要分為兩大類：化學(xué)吸附和物理吸附化學(xué)吸附熱大，吸附過(guò)程往往是不可逆的，而物理吸附熱小，吸附往往是可逆的。物理吸附與化學(xué)吸附產(chǎn)生物理吸附的作用力是分子間力,即范德華力.產(chǎn)生化學(xué)吸附的作用力是化學(xué)鍵力.化學(xué)吸附時(shí)可發(fā)生電子的轉(zhuǎn)移,原子的重排,化學(xué)鍵的斷裂與形成等微觀過(guò)程.物理吸附和化學(xué)吸附往往可以同時(shí)發(fā)生,如O2在W上的吸附.在不同的溫度下,起主導(dǎo)作用的吸附可以發(fā)生變化.物理吸附與化學(xué)吸附的比較吸附等溫線是指在一定溫度下物質(zhì)分子在兩相界面上進(jìn)行的吸附過(guò)程達(dá)到平衡時(shí)他們?cè)趦上嘀袧舛戎g的關(guān)系。在HPLC領(lǐng)域內(nèi)常遇到的吸附等溫線可分為以下幾類，即凸形、凹形、S形、H形和階梯形。吸附等溫線大致可歸納為五種類型，只有(a)符合單分子層吸附.其余皆為多分子層吸附。N2在活性炭上的吸附(－195

℃)幾種類型的吸附等溫線(a)(b)(c)(d)(e)VpN2在硅膠上的吸附(－195

℃)Br2在硅膠上的吸附(79

℃)苯在氧化鐵凝膠上的吸附(50

℃)水氣在活性碳上的吸附(100

℃)凸形吸附等溫線是液固系統(tǒng)中常見(jiàn)的一種，通常出現(xiàn)于大多數(shù)小分子化合物，它反映了溶質(zhì)分子在固體表面達(dá)到飽和時(shí)生成了單分子吸附層。H形等溫線是凸形等溫線的特殊狀態(tài)，它代表了一類很容易在固體表面吸附的物質(zhì)，而且很容易達(dá)到飽和態(tài)，這類吸附主要是一些分子量大的聚合物，如聚乙烯、聚苯乙烯等高聚物及酶、核酸、蛋白質(zhì)、糖等生物大分子。凹形吸附等溫線是適用于在低濃度下已吸附的被吸附分子又能吸附在液相中的分子、從而生成多分子吸附層的那些物質(zhì)。S形等溫線實(shí)際上是凹形和凸形兩種等溫線疊加的產(chǎn)物，它代表了被吸附的分子之間具有很強(qiáng)的作用力，能進(jìn)一步吸附其它分子，而溶質(zhì)分子與固體表面的作用力相對(duì)較弱，或者與表面覆蓋率無(wú)關(guān)。凹形凸形Cm線形CsSigtR峰形tRm圖8.分布等溫線類型及對(duì)色譜峰形和保留時(shí)間的影響

吸附等溫線信息1、可以預(yù)測(cè)代表了該吸附等溫線的組分在非線性色譜中色譜峰的形狀。2、為非線性色譜分離與純化物質(zhì)選擇最佳條件。3、反映被分離物質(zhì)分子與固定相表面的作用，從而研究分子的構(gòu)型與吸附狀態(tài)。4、建立分子結(jié)構(gòu)-吸附之間的定量關(guān)系，從而由分子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)吸附性能。吸附等溫線的測(cè)定吸附等溫線的測(cè)定可以分為靜態(tài)法與動(dòng)態(tài)法兩大類。1、靜態(tài)法：較簡(jiǎn)單，是一種經(jīng)典的方法，是將被測(cè)物質(zhì)溶解在溶劑中配成一定濃度的溶液，再放入一定量的固相吸附劑，等體系達(dá)到平衡后，根據(jù)溶液濃度的減少（△C）、溶液體積（V）和吸附劑量（G），就可以計(jì)算溶質(zhì)在吸附劑上的濃度（q）

q=△C×V/G配制一系列溶液濃度，可以得到一系列q值，將q與其相平衡的C做圖，即可得到該溶質(zhì)在液固系統(tǒng)中的吸附等溫線。2、動(dòng)態(tài)法動(dòng)態(tài)法最早是用氣相色譜原理來(lái)測(cè)定氣固或氣液兩相中的吸附等溫線的，常用的有4種方式：①前沿分析（FA）；②特征點(diǎn)前沿分析（FACP）；③特征點(diǎn)洗脫（ECP）；④平臺(tái)洗脫（EP）。前沿分析法(frontalanalysis，F(xiàn)A)是由James和Philips，1964年首先提出并將其用于單組分等溫線的測(cè)定。FA實(shí)驗(yàn)過(guò)程是在色譜柱入口處每隔一定時(shí)間連續(xù)壓入大量濃度不斷遞增的待測(cè)樣品。在FA中，對(duì)每一個(gè)濃度的樣品，進(jìn)樣量要足夠大，以保證其洗脫曲線中與進(jìn)樣濃度呈線性關(guān)系出現(xiàn)濃度平臺(tái)。由于FA在測(cè)定單組分等溫線時(shí)僅需要洗脫前沿出現(xiàn)時(shí)的保留時(shí)間和與其濃度相對(duì)應(yīng)的平臺(tái)高度，可以克服由低濃度數(shù)據(jù)點(diǎn)產(chǎn)生的誤差所造成的整個(gè)等溫線偏離的缺陷。二、非線性色譜基本理論非線性色譜理論是通過(guò)研究被分離物質(zhì)在兩相中呈高濃度情況下的濃度變化與吸附等溫線、傳質(zhì)速率、進(jìn)樣方式等因素的關(guān)系，建立起定量的函數(shù)形式，從而能預(yù)測(cè)最佳分離條件，得到滿意的分離結(jié)果。1、吸附平衡熱力學(xué)當(dāng)被分離的物質(zhì)在色譜系統(tǒng)中達(dá)到熱力學(xué)平衡時(shí)，它在液相與固相中的濃度關(guān)系可用吸附平衡方程式表示。

2、吸附平衡動(dòng)力學(xué)色譜分離過(guò)程實(shí)際上是一個(gè)由不平衡到平衡、周而復(fù)始的連續(xù)過(guò)程。平衡的速率由下式可以表達(dá)為：S+AS-AKaKddQdT=Ka(Q0–Q)–Kd*Q第三節(jié)非線性色譜的實(shí)驗(yàn)方法由于非線性色譜涉及的樣品濃度大大高于線性（分析型）色譜的，因此通常的分析型色譜儀及其流程就不完全符合非線性色譜的要求，某些部件必須加以改造才能滿足要求，以便于在優(yōu)化條件下使用，而且在實(shí)驗(yàn)方法上也需加以適當(dāng)?shù)母淖?。一、非線性色譜中的固定相及色譜柱1、固定相在生物大分子分析型高效液相色譜中的固定相目前幾乎都是用細(xì)顆粒大孔徑的填料，但是在非線性色譜中，粗和細(xì)的可以兩者都在使用。原則上講細(xì)顆粒填料的柱效要高，但價(jià)格也貴。粗顆粒填料雖柱效低，但價(jià)格便宜，而且柱壓降低適合于大型制備柱。材料：填料的基體仍以硅膠和有機(jī)樹(shù)脂兩大類為主。如果硅膠和有機(jī)樹(shù)脂基體的理化性能（如孔隙度、顆粒大小、比表面及鍵合的官能團(tuán)）都一樣，那么他們呈現(xiàn)的色譜性能沒(méi)有顯著的差別?？紫抖龋禾盍峡讖酱笮〉囊髮?duì)不同生物大分子也不一樣，例如分離核酸要求孔徑至少在50nm以上，分離蛋白質(zhì)一般要求在30-100nm，而且隨分子量不同而異。30-50nm可分離30-100kD的蛋白質(zhì)，而分離100kD以上的蛋白質(zhì)要求孔徑在80-100nm?？讖皆酱?，比表面越小，因而，填料對(duì)樣品的負(fù)載量也降低，而且機(jī)械強(qiáng)度也減弱。但是由于傳質(zhì)阻力減少而使不同范圍的蛋白質(zhì)都能得到分離，故使填料效率提高。分離生物大分子的主要填料1、反向填料：烷基鏈長(zhǎng)是很重要的因素。反向填料上鍵合的烷基鏈長(zhǎng)似乎與蛋白質(zhì)的分子量也有反相的關(guān)系，即長(zhǎng)鏈烷基填料適合于分離小肽，短鏈烷基適合于分離多肽及蛋白質(zhì)。2、疏水作用填料：這種填料的疏水作用比反向填料弱，主要是填料表面烷基密度小、鏈長(zhǎng)短。3、離子交換填料：包括強(qiáng)陽(yáng)離子、弱陽(yáng)離子、強(qiáng)陰離子、弱陰離子4種填料。4、體積排斥填料：無(wú)機(jī)填料一硅膠為主。有機(jī)填料中常用Pharmacia出的瓊脂類填料。5、親和填料：親和填料盡管選擇性好，但最大的問(wèn)題是商品種類太少，幾乎對(duì)每一種生物大分子的分離都需要合成該種大分子所需要的特殊親和填料。2、色譜柱及填充技術(shù)以分離純化為主要目的的非線性色譜與分析色譜一樣，色譜柱是極關(guān)鍵的部分。色譜柱關(guān)鍵考慮兩方面，一是色譜柱的長(zhǎng)度；二是柱的填充。色譜柱長(zhǎng)度的選擇要考慮多種因素：1、為達(dá)到一定的分離度就要求有一個(gè)起碼的柱長(zhǎng)，否則分離的組分就達(dá)不到所需的純度。2、不同的填充方法填充的色譜柱都有一個(gè)最長(zhǎng)的限度，超過(guò)了這個(gè)限度，就無(wú)法得到均勻的填充床。3、柱效也不是與柱長(zhǎng)永遠(yuǎn)呈比例增長(zhǎng)，超過(guò)某一長(zhǎng)度，柱效不再隨柱長(zhǎng)增加。4、高壓泵的容量不允許使用很長(zhǎng)的色譜柱。5、在置換色譜中，超過(guò)了最佳柱長(zhǎng)，反而會(huì)降低產(chǎn)率，提高成本6、柱徑的選擇也很重要。柱的填充柱的填充目前主要仍用干法和濕法兩種：1、干法操作簡(jiǎn)單、方便，不需要特殊設(shè)備，但柱效一般較差，只適用于直徑大于30μm的顆粒，而且更適用于直徑較大的色譜柱。2、濕法填充主要適用于20μm以下的顆粒填料，分恒流與恒壓填充2種。二、樣品溶解與進(jìn)樣方法用非線性色譜分離與純化生物大分子時(shí)，制備合適的樣品溶液是成敗的關(guān)鍵之一。1、蛋白質(zhì)的溶解度有限，通常需加入其他試劑一增加它在水中的溶解度。2、溶液的性質(zhì)必須適應(yīng)于所用的固定相，使大量的樣品溶液導(dǎo)入色譜柱后不馬上擴(kuò)散，集中在柱頭，以達(dá)到“塞式”進(jìn)樣目的。適當(dāng)溶液制備后，進(jìn)樣方式也十分重要。保證大量樣品溶液能均勻分布在柱的截面上，使軸向擴(kuò)散與局部超載降至最小。目前進(jìn)樣方式有兩種1、采用帶樣品管的六通進(jìn)樣閥。若樣品管的容積太大（如大于1ml），在空管中會(huì)產(chǎn)生Poiseuille徑向速度分布，使樣品溶液帶進(jìn)入柱頭時(shí)加寬，所以一個(gè)較好的辦法是用大于固定相顆粒2-3倍的惰性實(shí)心顆粒填充樣品管，可大大減少?gòu)较蛩俣炔痪鸬倪M(jìn)樣區(qū)變寬。2、用高壓泵直接輸送樣品進(jìn)入色譜柱，由于與流動(dòng)相混合，所以能保證樣品均勻進(jìn)入柱頭的橫截面。要注意樣品的濃度不能太高，以免析出沉淀。樣品進(jìn)入色譜柱也有多種方式，如中心注射、錐形注射、橫截面注射等。中心注射在進(jìn)樣體積較小時(shí)，分離效果好，但隨進(jìn)樣體積增大柱效逐漸降低，而橫截面注射恰恰相反。三、非線性色譜中3種常用的展開(kāi)方式超載洗脫、前沿分析和置換展開(kāi)是非線性色譜中常用的3中操作方式。在實(shí)際工作中究竟選擇什么方式要取決于樣品的性質(zhì)、所需的產(chǎn)品純度及要求的