黃精多糖提取純化工藝的優(yōu)化及其薄層鑒別方法的研究

黃精多糖提取純化工藝的優(yōu)化及其薄層鑒別方法的研究

黃精是中國傳統(tǒng)的藥物和食品中藥。具有益氣健脾、潤脾、健肝、補(bǔ)腎的功效。黃精多糖是黃精的主要活性成分之一,由葡萄糖、甘露糖和半乳糖醛酸等組成,具有降血脂、降血糖、增強(qiáng)記憶、抗病毒和增強(qiáng)肌體免疫力等藥理作用。目前黃精多糖的提取多采用熱水浸提工藝、超聲提取、微波提取等。本研究以黃精多糖提取率為評價指標(biāo),采用正交實驗設(shè)計,優(yōu)選黃精多糖的提取工藝,并建立黃精多糖的薄層鑒別方法,為黃精資源的進(jìn)一步開發(fā)利用和中藥新藥產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。1測定試材的選擇UV957S紫外-可見分光光度計(上海精密科學(xué)有限公司);電子天平(島津國際貿(mào)易有限公司,型號AUX220);蒽酮等試劑均為分析純。黃精藥材、桔梗藥材(購于成都荷花池藥材市場,經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院方清茂副研究員鑒定為中國藥典2005版一部收載品種);D-無水葡萄糖對照品(批號110833-200503)、黃精對照藥材(批號121341-200402)、桔梗對照藥材(批號121028-200608),以上對照品和對照藥材均購于中國藥品生物制品檢定所。2方法和結(jié)果2.1提取工藝正交試驗2.1.1因素水平水提取方法的主要影響因素為提取次數(shù)、提取時間、料液比。在單因素試驗的基礎(chǔ)上,進(jìn)行三因素三水平設(shè)計,見表1。2.1.2乙醇醇沉的制備采用L9(34)正交表,空白列為誤差項,進(jìn)行正交試驗。稱取藥材25.00g,共9份。分別按正交實驗表所列提取次數(shù)、提取時間、溶劑倍數(shù)加熱提取,抽濾,濾液濃縮至25mL,冷卻,攪拌下緩慢加入95%乙醇醇沉至80%。靜置過夜,抽濾,得沉淀9份,備用。2.1.3提取次數(shù)和提取時間對多糖提取率的影響取上述9份沉淀分別加蒸餾水溶解并轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中,加入蒸餾水至刻度,定容,搖勻。精密量取0.5mL溶液于100mL容量瓶,加入蒸餾水至刻度,定容,搖勻。精密量取上述溶液各0.5mL,分別置10mL具塞干燥試管中,照中國藥典2005版一部黃精含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下的方法,依法測定吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含無水葡萄糖的重量(mg),計算,即得。實驗結(jié)果及分析,見表2、3。由方差分析結(jié)果可見,A提取次數(shù)對多糖提取率有顯著性影響,C溶劑倍數(shù)有一定影響,B提取時間則對提取的結(jié)果無明顯影響。結(jié)合正交試驗因素水平影響結(jié)果,確定的最佳工藝條件為A2B3C2,即提取2次,加8倍量水提取,每次1h。2.1.4黃精多糖的含量取黃精藥材3份,根據(jù)篩選得到的優(yōu)化設(shè)計,對其進(jìn)行驗證,黃精多糖的含量分別為33.56%,33.74%,33.45%.平均含量為33.58%。2.2醇沉試驗2.2.1水平設(shè)計中的因素影響醇沉的主要因素有醇沉濃度、浸膏濃縮程度(藥材浸膏比)、醇沉次數(shù)等因素的影響。因素水平設(shè)計見表4。2.2.2乙醇沉對多糖提取率的影響取黃精450.0g,加水3600mL水煮提取2次,每次1h,抽濾,合并濾液,平均分為9份(每份相當(dāng)于藥材50g),分別按照因素水平表和正交實驗表所列實驗參數(shù),濃縮至不同程度,冷卻,攪拌下緩慢加入95%乙醇沉至不同濃度,并按要求醇沉1～3次后,靜置過夜,抽濾,沉淀置真空干燥箱55℃減壓干燥,稱重,計算多糖提取率(按藥材質(zhì)量計)。分別稱取提取物適量加蒸餾水溶解并轉(zhuǎn)移至100容量瓶中,加入蒸餾水稀釋至刻度,定容,搖勻,備用。方差分析表明,B浸膏濃縮程度對多糖提取率有顯著性影響,為最主要因素,C醇沉條件有顯著性影響也為主要因素,A醇沉濃度沒有影響,為次要因素。結(jié)合正交實驗結(jié)果,較好的黃精醇沉工藝條件為B3C2A3,即濃縮程度為藥材浸膏比1:0.7,醇沉濃度選為80%,醇沉次數(shù)為1次。2.2.4黃精多糖的含量取黃精藥材3份,根據(jù)篩選得到的優(yōu)化設(shè)計,對其進(jìn)行驗證,黃精多糖的含量分別為39.54%,39.72%,39.88%,平均含量為39.71%。2.3選擇和識別黃精中的薄膜識別2.3.1熱回流造林,制備成溶液取黃精2g,加入70%乙醇10mL,加熱回流1h,過濾,濾液揮干,殘渣用10mL丙酮溶解,過濾,濾液揮干,殘渣用0.5mL丙酮溶解,轉(zhuǎn)溶至1mL容量瓶中,備用。2.3.2黃精、對照材料和薄膜樣品的制備取黃精對照藥材2g,照黃精薄層樣品制備法制備。2.3.3確定展開劑系統(tǒng)以硅膠G-0.7%CMC-Na為吸附劑,以10%磷鉬酸乙醇液為顯色劑,分別篩選三個展開劑系統(tǒng):環(huán)己烷-乙酸乙酯-丙酮3:1:1,環(huán)己烷-氯仿-甲醇4:1:0.5,氯仿-丙酮4:1。結(jié)果展開劑氯仿-丙酮4:1,分離出的斑點多、分離效果好,確定其為最佳薄層層析條件。2.3.4不同展開劑的對比實驗結(jié)果以0.7%CMC-Na硅膠G為吸附劑,氯仿-丙酮4:1為展開劑,10%磷鉬酸乙醇液噴后于105℃烘烤至顯清晰斑點。結(jié)果見圖1。從以上薄層層析結(jié)果顯示,黃精藥材與黃精對照藥材在相同Rf值有相同顏色、相同形狀的斑點,黃精藥材符合要求。2.3.5黃精的成分、重量2.3.5.1.黃精薄膜樣品的制備2.3.5.陰性種粒劑的制備通過復(fù)方顆粒劑大量薄層試驗,證實復(fù)方中桔梗藥材對黃精陰性薄層樣品有干擾,因此,黃精陰性樣品制備時需缺黃精和桔梗。取缺黃精、桔梗的處方各組成物,按制劑制備方法制成黃精陰性顆粒劑。取該樣品0.12g,照黃精藥材薄層層析樣品制備法制備樣品,即得。2.3.5.附劑的制備以0.7%CMC-Na硅膠G為吸附劑,以氯仿-丙酮4:1為展開劑,以10%磷鉬酸乙醇液噴后于105℃烘烤顯色至顯清晰斑點。結(jié)果見圖2。3黃精的篩選3.1通過正交實驗優(yōu)化的水煮提取工藝為:用8倍量水煎煮2次,每次1h;純化最佳工藝為:醇沉濃度為80%,溶液濃縮程度至藥材:浸膏比1:0.7,醇沉次數(shù)為1次。3.2黃精藥材在2005版藥典中未收載薄層鑒別項,故對其薄層條件進(jìn)行了篩選,得出黃精的展開條件為氯仿-丙酮4:1,顯色劑以10%磷鉬酸乙醇液噴后于105℃烘烤至顯清晰斑點。3.3關(guān)于陰性樣品的考查在對成品的薄層鑒別發(fā)現(xiàn)桔梗對黃精陰性有干擾,故在陰性樣品的制備應(yīng)去掉干擾因素,最終得出可靠的薄層鑒別方法。2.2.3糖液中含無水葡萄糖含量的測定分別精