櫻桃花粉生長規(guī)律的研究

櫻桃花粉生長規(guī)律的研究

桃子是世界上常見的果樹之一，具有豐富的物種資源。目前，果樹栽培的桃子品種主要包括中國櫻桃、洋甘櫻桃、酸櫻桃和洋甘櫻桃。在我國用于經(jīng)濟(jì)栽培的有中國櫻桃和甜櫻桃,它們同屬于薔薇科櫻亞屬(Subgen.Cerasus),但中國櫻桃的大多數(shù)品種表現(xiàn)為自交親和性,而甜櫻桃大部分品種表現(xiàn)為自交不親和性。迄今,已經(jīng)證實(shí)甜櫻桃的花柱中存在S-RNase可分解花粉管內(nèi)的RNA,從而導(dǎo)致自交不親和;中國櫻桃的自交親和性機(jī)理尚未明確,有研究表明可能是S-RNase表達(dá)不足而致。雖然目前國內(nèi)外已經(jīng)廣泛開展對櫻桃等薔薇科果樹的自交不親和性(自交親和性)分子機(jī)理的研究,但對其生殖生理學(xué)上的研究,特別是花粉原位萌發(fā)和花粉管生長方面的研究卻非常少,目前只有在杏、果梅、沙梨和沙田柚上有相關(guān)報(bào)道。本研究選取中國櫻桃和甜櫻桃中的主栽品種為試材,應(yīng)用熒光顯微鏡觀察花粉原位萌發(fā)和花粉管在花柱中的生長動態(tài),直觀深入地了解中國櫻桃和甜櫻桃自花、異花花粉管生長的差異,為進(jìn)一步闡明中國櫻桃和甜櫻桃自交不親和性(自交親和性)機(jī)制及其自交和雜交育種提供相關(guān)的科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1材料中國櫻桃品種‘東塘’(Dongtang)和‘垂絲’(Chuisi)來自南京農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所櫻桃園,甜櫻桃品種‘莫利’(Jasmine)和‘拉賓斯’(Lapins)來自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝場。采集帶飽滿花芽的健壯枝條,光照培養(yǎng)于30g/L蔗糖溶液中。同時(shí)采集開花前1d或當(dāng)天花蕾,取出花藥,置于硫酸紙上,于干燥處自然散粉后裝入密閉瓶內(nèi),貯于-20℃冰柜內(nèi)備用。1.2授粉處理用已制備好的中國櫻桃和甜櫻桃花粉進(jìn)行自花和異花授粉,授粉組合如下:中國櫻桃組合:‘垂絲’自交、‘垂絲’ב東塘’;甜櫻桃組合:‘莫利’自交、‘拉賓斯’自交、‘莫利’ב拉賓斯’。授粉后分別于0.5、1、3、6、12、24、48、72、96和120h從花柱基部切取花柱,用FAA固定。1.3花粉萌發(fā)與花粉管生長的測定花柱壓片參照Kho等的方法,但對花柱軟化的時(shí)間和溫度進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。染色后用熒光顯微鏡觀察花粉萌發(fā)和花粉管生長情況,并進(jìn)行顯微拍攝,每個(gè)處理重復(fù)10根花柱,取平均值,并用stst數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行方差分析。2結(jié)果與分析2.1自花授粉和異花授粉花粉原位萌發(fā)的種間差異異花授粉后1h,中國櫻桃和甜櫻桃都有少量花粉開始萌發(fā),而自花授粉要到3h左右才有部分花粉萌發(fā)。授粉后3~48h內(nèi),無論是異花還是自花授粉,花粉萌發(fā)率迅速上升,并于授粉后96h到達(dá)各自的最大值,此后花粉萌發(fā)率基本保持穩(wěn)定。以‘垂絲’ב東塘’為例,其授粉后1h花粉開始萌發(fā),萌發(fā)率只有4.21%,到24h時(shí)已達(dá)77.25%,但仍可觀察到部分花粉未萌發(fā)(圖版Ⅰ,1),到96h時(shí)花粉萌發(fā)率高達(dá)97.50%,已經(jīng)很難發(fā)現(xiàn)未萌發(fā)的花粉(圖版Ⅰ,2)。雖然異花和自花授粉花粉萌發(fā)率的升高趨勢具有相似性,但同一時(shí)間段內(nèi),異花授粉花粉萌發(fā)率一直高于自花授粉,特別在授粉后的48h內(nèi),差異顯著(表1)?？偟膩碚f,無論是中國櫻桃還是甜櫻桃的自花或異花授粉,它們的花粉都能夠在柱頭正常萌發(fā),而且其花粉萌發(fā)率的差異只表現(xiàn)在數(shù)量上,并不存在本質(zhì)性差別。2.2花柱上部自花與異花花粉管生長的種間差異5個(gè)授粉組合中,只有甜櫻桃異花授粉組合‘莫利’ב拉賓斯’的花粉管在授粉后1h到達(dá)花柱上部,其余的到授粉后3h才在花柱上部觀察到花粉管,但在隨后的3h內(nèi)花粉管的數(shù)量都在成倍增長。此后,隨著時(shí)間的延長,中國櫻桃和甜櫻桃到達(dá)花柱上部的花粉管數(shù)量不斷增多,并表現(xiàn)出各自的增長特點(diǎn)(表2)。中國櫻桃自花與異花的花粉管在授粉后24~48h生長最快,表現(xiàn)為其花粉管數(shù)量增長的絕對值最大,分別為36根和40.8根;48~72h,兩者的花粉管生長開始趨于穩(wěn)定,且都于授粉后96h到達(dá)各自的最大值,分別為109.5根和118.6根。甜櫻桃異花花粉管在授粉后12~24h生長最快(用其花粉管增長的絕對值來衡量)?！e斯’自交的花粉管生長趨勢與‘莫利’ב拉賓斯’有著相似性,而‘莫利’自交花粉管生長的最快時(shí)間是授粉后的24~48h。3個(gè)組合都于授粉后96h達(dá)到各自最大值,但其花粉管數(shù)量差異顯著,‘莫利’ב拉賓斯’最多,為139.3根;‘拉賓斯’自交次之,為111.7根;‘莫利’自交最少,為72.9根(圖版Ⅰ,5~7)。根據(jù)以上結(jié)果分析,除甜櫻桃‘莫利’自交外,各組合花粉管在花柱上部生長正常。而‘莫利’自交則有部分花粉管生長受到抑制,但抑制程度還不高。2.3花柱中部自花與異花花粉管生長的種間差異由表3可以看出,無論是自花還是異花授粉,中國櫻桃花粉管最早于3~6h到達(dá)花柱中部;其后隨著時(shí)間的延長而增加,在48~72h內(nèi)增加的絕對值最大;72~120h花粉管數(shù)量仍在增加,但已不明顯。從花粉管到達(dá)花柱中部的趨勢看,中國櫻桃自花和異花花粉管的生長速度基本一致,這與甜櫻桃自花和異花花粉管生長情況不同。甜櫻桃自花和異花花粉管生長差異較大。授粉后3h,已有少量異花花粉管到達(dá)花柱中部,但‘拉賓斯’與‘莫利’自交分別于授粉后6h和12h才有少量花粉管生長到中部。異花授粉的120h,花粉管到達(dá)花柱中部的數(shù)量一直在增加,其中,24~48h增加最明顯,到120h時(shí)到達(dá)最大值101.2根。‘拉賓斯’自交則在48~72h增加較明顯,同樣于120h時(shí)到達(dá)最大值58.2根。在授粉后12~120h內(nèi),‘莫利’自花花粉管到達(dá)花柱中部的數(shù)量少,且隨著時(shí)間延長,增加不明顯(表3)。各組合最終到達(dá)花柱中部的花粉管數(shù)量出現(xiàn)一個(gè)比較明顯的三級分化,‘莫利’ב拉賓斯’最多,中國櫻桃自花異花組合及‘拉賓斯’自交居中,‘莫利’自交最少。從圖版Ⅰ,10、11中的明顯對比也可以反映這一現(xiàn)象。此外,前兩者花粉管生長狀況良好(圖版Ⅰ,9),后者大部分花粉管生長受到抑制,表現(xiàn)為花粉管停止生長,頂部膨大(圖版Ⅰ,8)。2.4花柱基部自花與異花花粉管生長差異授粉后12~24h內(nèi),中國櫻桃已有少數(shù)自花和異花花粉管到達(dá)花柱基部,96h時(shí)花粉管數(shù)量已經(jīng)到達(dá)最大值,到120h時(shí)基本變化不大,分別為2.9和8.8根(圖版Ⅰ,12、13;表4)。雖然自花授粉到達(dá)花柱基部的花粉管數(shù)量比異花授粉的要少,但仍然有部分到達(dá),可見,中國櫻桃自交親和性比較強(qiáng)。甜櫻桃授粉組合間,花粉管到達(dá)基部的數(shù)量和速度都有差異?！痢e斯’于授粉后12h就有部分花粉管長到基部,并于96h到達(dá)最大值;‘拉賓斯’自交于授粉后24h在基部觀察到部分花粉管,同樣于96h到達(dá)最大值;‘莫利’自交在基部幾乎沒有觀察到花粉管(圖版Ⅰ,14~16;表4)?？梢?甜櫻桃異花授粉的雜交親和性很強(qiáng),而自花授粉中‘拉賓斯’表現(xiàn)為自交親和性,‘莫利’表現(xiàn)為自交不親和性。3討論植物成功授粉首先依賴于柱頭表面與花粉的粘附能力,同屬于薔薇科櫻亞屬的中國櫻桃和甜櫻桃都有一個(gè)濕性柱頭,且表面分泌物有較大的粘性,有利于花粉的粘附、萌發(fā)。本研究表明,中國櫻桃和甜櫻桃的花粉都能夠在自花或異花柱頭上萌發(fā),且萌發(fā)出的花粉管都生長正常(圖版Ⅰ,3)。這一點(diǎn)與配子體自交不親和性現(xiàn)象相符,其花柱與花粉間的識別部位并非是柱頭。中國櫻桃和甜櫻桃花粉在柱頭萌發(fā)以后,均能夠沿著花柱定向生長,在授粉后3h內(nèi)有一個(gè)迅速生長期,然后進(jìn)入相對較長的緩慢生長階段,隨后又進(jìn)入第二個(gè)快速生長時(shí)期,最后生長減慢并趨于穩(wěn)定,總體來說花粉管在花柱中的生長表現(xiàn)為“極快-慢-快-穩(wěn)定”的動態(tài)變化過程,這與Li和Geitmann的研究具有相似性,其把第一個(gè)極快生長階段稱為花粉管的脈沖式生長。此外中國櫻桃和甜櫻桃的雜交親和性都非常強(qiáng),表現(xiàn)為其雜交授粉的花粉萌發(fā)速度和萌發(fā)率比各自自花授粉的要快且多,而花粉管到達(dá)花柱基部的時(shí)間和數(shù)量與各自自花授粉的相比也是如此。雖然中國櫻桃和甜櫻桃的花粉萌發(fā)和花粉管生長特征有一定的相似性,但差異也非常明顯。在花粉萌發(fā)上,中國櫻桃和甜櫻桃各組合萌發(fā)率表現(xiàn)為‘莫利’ב拉賓斯’>‘拉賓斯’自交>‘垂絲’ב東塘’>‘垂絲’自交>‘莫利’自交,可見甜櫻桃除了‘莫利’自交外,其花粉原位萌發(fā)率要高于中國櫻桃。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)中國櫻桃有極少部分花粉在柱頭上萌發(fā)后不能夠正常進(jìn)入柱頭(圖版Ⅰ,4)。這可能是因?yàn)橹袊鴻烟业幕ㄋ幈忍饳烟乙?散粉量也少,從而影響中國櫻桃的花粉質(zhì)量,導(dǎo)致中國櫻桃原位萌發(fā)率不高。在花粉管生長上,雖然兩者花粉管生長的動態(tài)變化過程相似,但中國櫻桃的緩慢生長期明顯比甜櫻桃要長,表現(xiàn)為甜櫻桃在授粉后24h左右花柱上部的花粉管數(shù)目明顯增加(‘莫利’自交除外),而中國櫻桃于授粉后48h左右花粉管的生長速度才加快。此外,同為自花授粉,中國櫻桃‘垂絲’自交的花粉管能夠到達(dá)花柱基部,表現(xiàn)為自交親和;甜櫻桃‘拉賓斯’自交的花粉管也能夠到達(dá)花柱基部,而‘莫利’自交則表現(xiàn)為極強(qiáng)的自交不親和性,其花粉管能夠進(jìn)入柱頭,但在花柱的中上部被抑制,這一現(xiàn)象與配子體自交不親和花粉管的生長特性相一致,進(jìn)一步驗(yàn)證了甜櫻桃的配子體自交不親和性。中國櫻桃和甜櫻桃自花、異花花粉管的生長特性說明,雖然櫻桃屬于配子體自交不親和果樹,但中國櫻桃在長期的進(jìn)化過程中發(fā)生變異,表現(xiàn)為自交親和性;而甜櫻桃‘拉賓斯’是人工選育的自交親和性品種,因其花粉發(fā)生突變而致,是甜櫻桃中少有的幾個(gè)自交親和品種之一,大部分甜櫻桃品種自交不親和。目前,已明確甜櫻桃自交不親和性是由S基因座控制的,而‘拉賓斯’等甜櫻桃自交親和品種的產(chǎn)生正是與該基因座的突變有關(guān)。其S4