過敏性過氧化應激劑對哮喘小鼠細胞il

過敏性過氧化應激劑對哮喘小鼠細胞il

專業(yè)免疫治療（sit）被認為是一種獨特的病因治療哮喘的療法，但其具體機制尚不清楚。既往的研究多集中在該方法對IgE的影響上。但IgE主要介導哮喘的速發(fā)相反應,對氣道的慢性變應性炎癥不起重要作用。研究證明,哮喘患者具有明顯的Th1/Th2細胞因子偏移,即Th2細胞因子表達明顯增加。近年發(fā)現(xiàn),SIT可下調(diào)CD4+T細胞的免疫功能,糾正Th1/Th2細胞的偏移。但其作用機制仍不完全清楚。文獻報道,大劑量過敏原誘導T細胞免疫耐受的機制可能涉及到抗原特異性的Th2細胞克隆凋亡或不反應性。本實驗利用不同濃度過敏原在體外條件下處理哮喘小鼠T細胞,觀察各濃度處理組IL-5產(chǎn)生的情況和T細胞的凋亡情況,旨在探討大劑量過敏原誘導哮喘T淋巴細胞免疫耐受的基本機制。1材料和方法1.1細胞分離液和tunel試劑盒雞卵蛋白系Sigma公司產(chǎn)品,淋巴細胞分離液為上海試劑二廠產(chǎn)品,ELISA試劑盒購自美國,TUNEL試劑盒系Roche公司產(chǎn)品。1.2兩組患者ova的注射及激發(fā)健康雌性BALB/c小鼠60只,4～6周齡,體質(zhì)量21.3～23.6g,由本校實驗動物中心提供,隨機分為兩組:①實驗組:分別于第1、13天予OVA/Al(OH)3混合液0.1ml腹腔注射[內(nèi)含OVA10μg,Al(OH)31mg],第21～29天每天予2%OVA生理鹽水溶液霧化吸入激發(fā)30min或直至出現(xiàn)哮喘樣發(fā)作時為止。②對照組:用生理鹽水替代OVA腹腔注射及激發(fā)。每組30只小鼠,分5個處理濃度級,每濃度級用6只小鼠。1.3調(diào)節(jié)性細胞rpmi在最后一次激發(fā)結(jié)束24h后,將小鼠脫頸椎致死,開腹無菌取脾,常規(guī)分離單個核細胞。2000r/min離心洗滌2次后,用含10%Fbs的RPMI1640培養(yǎng)液5ml重懸。將此細胞懸液加至玻璃培養(yǎng)皿中,置5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后取出,用尖吸管輕輕吹打細胞懸液,使淋巴細胞吹脫,吸出懸液,用細胞刮刀將吸附在平皿表面的單核細胞刮離,洗滌后用RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)細胞濃度為4×105/ml。尼龍毛柱法提純T淋巴細胞,調(diào)細胞濃度為1×106/ml。1.4ova鹽水利益檢測96孔培養(yǎng)板內(nèi)加入兩實驗組T細胞5×104/ml,單核細胞2×104/ml(共0.1ml),再分別加入終濃度為0.1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、10mg/ml的OVA生理鹽水溶液,空白對照組以0.1ml生理鹽水替代加入。每濃度組均設三復孔。置培養(yǎng)板于5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后,取上清液測其IL-5水平;收集細胞行TUNEL染色檢測T細胞的凋亡情況。1.5抗體添加量按照說明書步驟進行。加100μl標準對照、待測樣品和空白對照(樣品稀釋液)到已包被好的培養(yǎng)板孔內(nèi),37℃孵育90min;洗板,每孔加入50μl抗體,混合30s,37℃孵育60min;洗板,每孔加入50μl抗體,混合30s,37℃孵育60min;洗板,每孔加入50μl抗體,混合30s,37℃孵育60min;洗板,用50μl終止液終止顯色,10min內(nèi)用酶標儀在450nm波長處測定光密度值。1.6合成細胞劑3.按照說明書步驟進行。收集培養(yǎng)板中的細胞,4%多聚甲醛固定,0.01mol/LPBS漂洗5min,3次。0.1%TritonX-100,4℃通透2min。PBS漂洗5min,3次。0.03%H2O2/0.01%NaN3封閉30min。PBS漂洗5min,3次。加入由末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)、脫氧三磷酸核苷(dNTP)和熒光素標記的脫氧三磷酸尿苷(dUTP)組成的TUNEL反應混合液20μl/片,37℃反應1h。PBS漂洗5min,3次。加入過氧化物酶(POD)標記的抗熒光素抗體20μl/片,37℃反應30min。PBS漂洗5min,3次。0.05%DAB/0.01%H2O2顯色,光鏡下控制顯色深淺。蘇木精復染。脫水,透明,封片。計數(shù):在高倍光鏡下隨機選擇視野,計數(shù)1000個細胞,計算凋亡率。1.7統(tǒng)計處理用ˉx±sxˉ±s表示,采用t檢驗、單因素方差分析和χ2檢驗。2結(jié)果2.1t細胞il-5表達變化隨著OVA濃度升高,哮喘組IL-5的水平亦明顯升高,至100μg/ml處理濃度級時IL-5水平達最高,但在10mg/mlOVA處理濃度級,T細胞產(chǎn)生的IL-5水平卻較其它幾個低濃度組明顯下降(P<0.01),甚至低于空白對照(P<0.01);對照組經(jīng)不同OVA濃度處理后T細胞產(chǎn)生的IL-5水平?jīng)]有改變。見表1。2.2凋亡率的測定各濃度處理組T細胞行TUNEL染色,DAB顯色,呈棕黃色者即為凋亡細胞。各組分別隨機計數(shù)1000個細胞,計算凋亡率。凋亡率(%)=凋亡染色陽性的細胞數(shù)細胞總數(shù)×100%結(jié)果見表2,哮喘組、對照組之間凋亡率無顯著差異(P>0.05),哮喘組、對照組內(nèi)不同處理濃度級之間凋亡率亦無明顯差異(P>0.05)。3大劑量工傷保護對t細胞il-5和th2細胞因子的抑制作用哮喘的發(fā)病可以在一定程度上視為一種免疫耐受機制缺陷的疾病,即正常人接觸過敏原后機體產(chǎn)生免疫耐受,不會始動哮喘的發(fā)病過程。相反,哮喘患者接觸過敏原后即可活化Th2細胞,始動哮喘發(fā)病過程。過敏原的特異性免疫治療的經(jīng)驗告訴我們,大劑量的過敏原可以導致患者對特異性過敏原在一定程度上的“免疫耐受”。所以,我們用不同劑量過敏原處理OVA特異性淋巴細胞,觀察大劑量過敏原對T細胞IL-5產(chǎn)生的影響及機制,了解特異性免疫治療的作用機制,為進一步提高免疫治療的療效提供理論依據(jù)。Janssen等的研究報道肺引流淋巴結(jié)細胞予終濃度為10μg/ml的OVA體外處理后,其IL-5的產(chǎn)生水平達到1500pg/ml。我們利用高于該濃度1000倍的OVA體外處理哮喘小鼠脾臟T細胞,結(jié)果顯示,哮喘小鼠T細胞培養(yǎng)上清中IL-5水平隨OVA處理濃度的增高而增高(P<0.01),至100μg/ml濃度級達最高值。但在10mg/ml的大劑量過敏原處理后哮喘T細胞IL-5的產(chǎn)生卻較幾個低濃度組顯著降低(P<0.01),甚至低于對照組IL-5的基礎分泌水平,此結(jié)果與Derry等所報道的基本一致。表明大劑量過敏原能抑制哮喘T細胞IL-5的產(chǎn)生,從而糾正Th1/Th2細胞因子的失衡。同時也提示,哮喘對過敏原的免疫耐受缺陷可能通過接觸大劑量的過敏原進行糾正,使T細胞產(chǎn)生的IL-5的恢復到正常的水平。IL-5是Th2細胞產(chǎn)生的代表性細胞因子,具有刺激哮喘患者骨髓的IL-5生成增多,趨化Eos在氣道內(nèi)的聚集,并活化Eos,在哮喘氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此,大劑量過敏原抑制T細胞IL-5產(chǎn)生是SIT治療哮喘的機制之一。文獻報道,經(jīng)SIT治療的患者可出現(xiàn)抗原特異性Th2淋巴細胞的凋亡現(xiàn)象。Th2的凋亡使Th1/Th2細胞的失衡得到糾正,從而導致Th2細胞因子(如IL-5)的產(chǎn)生減少。在本試驗中,我們同時檢測了T細胞的凋亡情況。結(jié)果顯示,不同濃度過敏原處理后T細胞的凋亡率沒有變化。其原因可能是過敏原與T細胞在體外培養(yǎng)的時間較短,T細胞尚未發(fā)生凋亡。而IL-5產(chǎn)生減少的原因可能是大劑量過敏原導致T淋巴細胞出現(xiàn)不反應性(Anergy)。在此情況下,抗原特異性T細胞雖未發(fā)生細胞凋亡,使細胞數(shù)量減少,但T細胞處于對變應原不反應的狀態(tài),Th2細胞