補脾益腸丸對腸易激綜合征內(nèi)臟高敏大鼠模型的防治作用

補脾益腸丸對腸易激綜合征內(nèi)臟高敏大鼠模型的防治作用

腸易激綜合征（ibs）是一種腸功能疾病，伴有腹痛和腹部不適，以及糞便習(xí)慣和糞便狀態(tài)的變化。可能沒有能夠解釋癥狀的語言學(xué)和生化學(xué)異常。內(nèi)臟敏感性增高,是胃腸運動紊亂、腹痛及癥狀多樣化的原因,被認(rèn)為是IBS的主要病理生理機(jī)制。IBS患者癥狀多樣化,西醫(yī)缺乏特異有效的治療方法,中醫(yī)藥對該病防治有一定優(yōu)勢。本研究采用母子分離法復(fù)制內(nèi)臟高敏大鼠模型,觀察大鼠腸腔壓力動態(tài)變化、避水應(yīng)激排便反應(yīng),并檢測大鼠血清、腦組織、結(jié)腸粘膜5-HT水平變化探討中藥復(fù)方補脾益腸丸對IBS的治療作用,為臨床用藥提供實驗依據(jù)。1材料和方法1.1試驗藥物補脾益腸丸由廣州陳李濟(jì)藥廠有限公司生產(chǎn)提供,批號:EM2921;匹維溴銨片(得舒特),蘇威制藥生產(chǎn),批號:622363。1.2省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供SPF級SD大鼠6窩,每窩12只,22天齡。廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(粵)2008-0002。飼養(yǎng)環(huán)境:廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心及廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級動物房。1.3試劑人體潤滑劑,廣州市舒友日用品有限公司生產(chǎn),批號:TY1201;5-HT酶聯(lián)免疫分析試劑盒,RB公司分裝。1.4儀器血壓計,酶標(biāo)儀(Bio-rad)。1.5大鼠腸道敏感性評估將6窩新生大鼠按窩分為6組,即正常對照組、模型對照組、補脾益腸丸小、中、大劑量組和匹維溴銨組,每窩12只,雌雄均有。補脾益腸丸小、中、大劑量按臨床人日用量的5、10、20倍設(shè)計,匹維溴銨按臨床人日用量的10倍設(shè)計。除正常對照組外,其余各組新生大鼠從出生后第2天開始進(jìn)行母子分離(將乳鼠從母鼠籠中拿出),每天3h,分離結(jié)束后再放回母鼠籠中一起喂養(yǎng),至第14天分離結(jié)束。從第15天后的2周內(nèi)不進(jìn)行任何操作。以上母子分離操作在廣東省實驗動物中心SPF級動物室完成。大鼠離乳后(第22天)送入廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗動物室,按雌雄分籠飼養(yǎng)。各組大鼠于第6周、第8周分別進(jìn)行腸道敏感性評估,評價模型是否成功。第9周開始進(jìn)行藥物治療,空白及模型對照組給予蒸餾水,補脾益腸丸各組分別給予大(6g/kg)、中(3g/kg)、小劑量(1.5g/kg)藥物,匹維溴銨組給予匹維溴銨(33mg/kg),每天一次,大鼠按1ml/100g體重灌胃給藥,連續(xù)2周,于第10周給藥結(jié)束后,再次進(jìn)行腸道敏感性評估。第11周進(jìn)行避水應(yīng)激試驗。實驗結(jié)束后,眼眶靜脈叢采血2ml,4℃靜置30min,3000r離心15分鐘,取血清。脫頸椎處死大鼠,剖開腹腔取整段結(jié)腸,生理鹽水(冰冷)沖洗數(shù)次后,冰上刮取結(jié)腸粘膜。打開顱骨,取大鼠腦組織。以上樣品均放于-80℃冰箱備用。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定樣品中5-HT水平。1.5.1大鼠腸腔壓力閾值的檢測采用大鼠腹部回縮反射(AWR)壓力值評估腸道敏感性。本實驗室將血壓計改造成腸腔壓力檢測器:一端連接血壓計充氣球囊,一端連接導(dǎo)尿管(14Fr)。導(dǎo)尿管另一端綁制插入大鼠腸腔的氣囊(第6周評估氣囊長度為2cm),充盈氣囊12h后使用。人體潤滑液涂抹氣囊后經(jīng)大鼠肛門插入4cm,用線將導(dǎo)尿管與大鼠尾巴固定,防止氣囊脫出。插好氣囊的大鼠放入特制透明的塑料容器內(nèi),待大鼠安靜,腹部貼于容器底面開始緩慢打氣,分別觀察引起大鼠腹部抬起以及背部拱起的壓力值,每只大鼠重復(fù)檢測3次,數(shù)據(jù)取均值進(jìn)行統(tǒng)計處理。第8周再次進(jìn)行腸道敏感性評估(氣囊制備如前,氣囊長度為3cm)。比較各組大鼠腸腔壓力閾值的差異。于第10周給藥結(jié)束后,再次進(jìn)行腸道敏感性評估。為保證實驗數(shù)據(jù)均一,評估實驗人員固定。1.5.2水面大小分析在直徑60cm的圓盆中裝滿水,將大鼠放于9cm×7.5cm×15cm特制平臺上,水面低于平臺約1cm。觀察大鼠站立于平臺上1h內(nèi)排便粒數(shù),評價模型大鼠在應(yīng)激狀態(tài)下腸道運動變化及補脾益腸丸對模型大鼠腸道運動的影響。2結(jié)果2.1分離法致大鼠腸道敏感性增強(qiáng)與正常對照組比較,模型大鼠第6w、第8w腸腔壓力值(抬腹、拱背)明顯降低(P<0.01),提示母子分離法導(dǎo)致了大鼠腸道敏感性增強(qiáng),表現(xiàn)出類似腸易激綜合征的腸道痛閾降低反應(yīng),見表1。2.2白鼠內(nèi)臟高敏模型給藥2w后,母子分離模型組大鼠抬腹、拱背壓力值仍明顯低于正常對照組,提示該法引起的IBS內(nèi)臟高敏模型持續(xù)時間較長,2w內(nèi)沒有自然恢復(fù)傾向。與模型組比較,補脾益腸丸中、大劑量組及匹維溴銨組大鼠抬腹、拱背壓力值明顯增高,提示上述藥物可以恢復(fù)該模型大鼠腸道的高敏感性,有利于緩解腸易激綜合征腸道癥狀,見表2。2.3腸道運動增強(qiáng)結(jié)果表明,與正常對照組比較,母子分離法模型組大鼠應(yīng)激后1h排便粒數(shù)明顯增多,提示在應(yīng)激刺激下,模型大鼠腸道運動增強(qiáng),促進(jìn)排便反應(yīng)。與模型組比較,各給藥組大鼠1h排便粒數(shù)顯著減少,提示藥物可能有降低應(yīng)激狀態(tài)下腸道異常運動的作用,見表3。2.4黏膜5-ht含量與正常大鼠比較,母子分離大鼠模型腦組織和腸粘膜5-HT含量均顯著增高,血清中無明顯變化。經(jīng)藥物治療后,補脾益腸丸大、中、小劑量及匹維溴銨均可降低腸粘膜5-HT含量,見表4。3內(nèi)臟敏感性評估IBS是臨床常見的慢性功能性胃腸疾病之一,其發(fā)病機(jī)制目前尚不完全明確,主要病因包括:精神因素、遺傳因素、感染、食物、神經(jīng)內(nèi)分泌因素。內(nèi)臟敏感性增高被認(rèn)為是IBS主要的病理生理基礎(chǔ)之一,甚至認(rèn)為其是IBS的生物學(xué)標(biāo)志,也是目前研究的熱點。通常采用引起感覺的容量閾值或壓力閾值對內(nèi)臟敏感性進(jìn)行評估。內(nèi)臟高敏感是指內(nèi)臟組織對刺激的感受性增強(qiáng),表現(xiàn)為引起各種感覺的容量或壓力閾值降低,和(或)對一定強(qiáng)度刺激的反應(yīng)增強(qiáng),是引起IBS患者腹痛、腹部不適的主要原因。目前較為常用的評價內(nèi)臟敏感性增高的方法有直腸球囊擴(kuò)張刺激等,結(jié)直腸擴(kuò)張引起的內(nèi)臟運動反應(yīng)可量化和重復(fù),是評價內(nèi)臟痛的可靠指標(biāo),已被廣泛應(yīng)用。已有實驗證實幼年時期反復(fù)的外周刺激可以導(dǎo)致成年后慢性內(nèi)臟高敏感性的產(chǎn)生。3.1新生兒期應(yīng)激IBS早期生活應(yīng)激事件,如童年被忽視、失去父母、受虐待等能夠影響結(jié)腸動力和引起內(nèi)臟痛覺過敏,可以造成成年后腹痛相關(guān)的功能性胃腸病發(fā)生的危險性增加。新生期母嬰分離(NMS)是新生兒期的最為常見的生活應(yīng)激事件,國內(nèi)外大多數(shù)研究采用NMS建立慢性大鼠內(nèi)臟高敏感性模型。大鼠從出生到第21天,被認(rèn)為是應(yīng)激的低反應(yīng)期,但這個時期卻能被一種強(qiáng)烈的應(yīng)激源即母嬰分離所抑制。新生期母嬰分離,一方面使新生大鼠由于缺少鼠乳的營養(yǎng)供應(yīng)導(dǎo)致腎上腺恢復(fù)了對ACTH的反應(yīng),另一方面缺少母鼠與新生大鼠間的觸覺刺激會使新生大鼠的腦垂體ACTH恢復(fù)對新穎環(huán)境的反應(yīng)。本實驗中在大鼠出生后2～14天給予每天3h母子分離刺激,可明顯造成大鼠之后(6w、8w、10w)結(jié)腸敏感性顯著增高,且持久穩(wěn)定,該模型有助于IBS等腹痛相關(guān)功能性腸病的病理及防治機(jī)制研究。3.25不同分型對小鼠腸黏膜5-ht含量的影響在外周,人體約95%的5-HT分布于胃腸道,其中90%合成、分布于粘膜層腸嗜鉻細(xì)胞,僅少數(shù)存在于腸神經(jīng)叢,主要參與胃腸道感覺、運動和分泌功能的調(diào)節(jié)。5-HT信號的改變可導(dǎo)致IBS的腸道癥狀和腸外癥狀。李兆申等對不同分型(腹瀉型/便秘型)IBS患者腸粘膜活檢發(fā)現(xiàn),IBS患者分泌5-HT的腸嗜鉻細(xì)胞數(shù)量顯著增多,功能活躍,細(xì)胞內(nèi)合成的5-HT增加。但亦有研究顯示:不同分型(腹瀉型/便秘型)IBS小腸粘膜5-HT含量表達(dá)不同。本實驗對母子分離內(nèi)臟高敏模型大鼠血清、腦組織及結(jié)腸粘膜5-HT含量進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),腦組織中5-HT含量最高,其次是結(jié)腸組織,再次是血清,且模型動物腦組織及結(jié)腸粘膜中5-HT含量均高于正常動物,特別是結(jié)腸粘膜中5-HT含量增高尤其顯著,而血清中5-HT變化不明顯。提示5-HT的增高與該模型中出現(xiàn)結(jié)腸痛閾降低、敏感性增高有關(guān),且發(fā)病部位結(jié)腸粘膜的表達(dá)高于中樞系統(tǒng)。3.3補脾益腸丸對腹瀉型is的防治作用補脾益腸丸的功效為補中益氣、健脾和胃、澀腸止瀉。臨床用于脾虛泄瀉之腹瀉、腹痛、腹脹、腸鳴等。腹瀉型IBS屬中醫(yī)學(xué)的泄瀉范疇,病機(jī)多為脾胃虛弱,健運無力,或肝氣不疏,克犯脾土。脾胃虛衰,不能受納水谷運化精微,而致水谷停滯,清濁不分,混雜而下,表現(xiàn)為泄瀉。臨床實踐表明,補脾益腸丸對于腹瀉型IBS有防治作用。本研究通過動物實驗