第二十章 煙草特征呈味成分的鑒定及分析方法

第二十章煙草特征呈味成分的鑒定及分析方法前言

我今天要給大家講課的內(nèi)容不僅涉及煙草香味成分的分析，而且涉及天然及合成香料以及香精的分析。今天的內(nèi)容主要是面上的，如果涉及較深入或具體的內(nèi)容我們可以留待以后分出若干課題來(lái)共同探討，例如涉及GC-MS測(cè)定方法、涉及LC-MS分析方法以及NMR、X-射線衍射等等，也可分別請(qǐng)國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家來(lái)講。我今天講的盡可能面上都講到，達(dá)到拋磚引玉的作用及目的。關(guān)于香氣成分的分析我想分成以下三個(gè)大方面給予介紹

取樣

分離的方法

鑒定的方法一、取樣取樣是確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確性及代表性最關(guān)鍵步驟之一。在香味物質(zhì)分析時(shí)，仔細(xì)地將所取樣品與參照標(biāo)準(zhǔn)品的香氣進(jìn)行比較是必須的，還應(yīng)經(jīng)常注意可能出現(xiàn)的各種問(wèn)題。香料取樣存在的問(wèn)題例子包括：（1）二相或多相：在桶里或其它容器中的水或固體物的存在。（2）不均勻性：例如常見(jiàn)的沒(méi)藥或乳香這樣一類(lèi)粗樹(shù)膠，它們是由不規(guī)則的塊狀固體組成的。

（3）浸膏香脂則是一類(lèi)粘滯的半固體的物料，它們的取樣應(yīng)予注意。取樣方法可參見(jiàn)[Kolthoff,I.M.,andElving,P.J.,eds.(1978)的書(shū)“TreatiseonAnalyticalChemistry”P(pán)arti.Zeded.,Vol.IWiley,NewYork]或其它國(guó)內(nèi)外有關(guān)書(shū)籍。

取樣應(yīng)根據(jù)研究目的、也應(yīng)根據(jù)分析對(duì)象的狀態(tài)加以考慮。例如：煙草烘絲過(guò)程中的香氣損失或變化可考慮對(duì)氣態(tài)的取樣。二、分離方法

在許多情況下（包括濃的香精、香基、精油及化學(xué)品），對(duì)試樣沒(méi)有必要進(jìn)行分離或濃縮就可以直接進(jìn)行分析。而在更多的情況下，要對(duì)香氣成分進(jìn)行分析就必須從試樣中分離出我們所要研究的組分。通常先做一些小試管量的試驗(yàn)或其它小試驗(yàn)有助于選擇合適的分離技術(shù)。同時(shí)，在一些試驗(yàn)中，注意觀察香氣的持久性、穩(wěn)定性、及揮發(fā)性和功能性的變化。這樣分析工作者就可以初步?jīng)Q定對(duì)香氣分析是按常規(guī)方法，還是應(yīng)用比較特殊的方法。對(duì)方法的選擇，主要考慮將要分析的范圍，所希望得到的分析內(nèi)容以及加香對(duì)象或基質(zhì)、介質(zhì)的特性。（一）蒸餾技術(shù)所有的蒸餾方法、目的均為使分析對(duì)象的揮發(fā)性組分與非揮發(fā)性組分或揮發(fā)性較低的組分分離開(kāi)。與提取法相比，優(yōu)點(diǎn)是：沒(méi)有非揮發(fā)性成分存在，不會(huì)干擾其后的色譜分析；缺點(diǎn)是蒸餾后若得到的是稀水溶液，則需要增加一個(gè)分離步驟，把揮發(fā)物分離出來(lái)。（我們?cè)谕瑯訔l件下曾做過(guò)對(duì)比分析，其色譜峰形明顯不同）。1.水蒸汽蒸餾可分為常壓和減壓兩各種類(lèi)型。基本原理類(lèi)似于化學(xué)分析中煙堿分析中的水汽蒸餾?，F(xiàn)設(shè)計(jì)有不同的小型裝置2.分餾根據(jù)沸點(diǎn)不同，用經(jīng)典填充柱和高回流比的分流操作，經(jīng)常能夠完成必要的分離。由于柱滯留容積相當(dāng)大，在試樣量較小時(shí)此法不宜使用。此法適合于對(duì)熱穩(wěn)定性強(qiáng)且有足夠量的物質(zhì)分離，例如可將30磅綠葉油分離成4個(gè)主要餾分，其中各個(gè)餾分再分別用不同方法分離處理，鑒定出香味成分。3.高真空蒸餾此方法適用于從非揮發(fā)油中分離出少量揮發(fā)物，也適用于分離食品或煙草等體系揮發(fā)性物質(zhì)，所要達(dá)到的真空度要看分離對(duì)象中是否有水，當(dāng)無(wú)水時(shí)，此法真空度可達(dá)10-3mmHg(0.133pa)或更低，此時(shí)是分子蒸餾，當(dāng)有少量水存在時(shí)，可實(shí)現(xiàn)高真空蒸餾。此圖是一種高真空蒸餾系統(tǒng)草圖，此方法分離香味成分體系中不會(huì)產(chǎn)生新化合物。4.分子蒸餾所謂分子蒸餾，也就是在蒸餾中被蒸餾分子從液體表面蒸發(fā)到被冷凝下來(lái)的冷卻表面之間的距離小于分子的“平均自由行程”的蒸餾。要實(shí)現(xiàn)分子蒸餾有兩個(gè)條件：第一，蒸發(fā)面到冷卻面之間盡可能有小的間距；第二，體系要有較低的壓力（10-3mmHg柱，0.133Pa）。一般有兩種蒸餾裝置可進(jìn)行分子蒸餾，一種是流動(dòng)薄膜蒸餾鍋，另一種是鍋式蒸餾鍋。前者適用于處理大量的分離對(duì)象（0.1-2L），后者適合于小量分離體系(0.01-0.1L)。(二)提取1.原理該方法原理是基于香味成分在溶劑相和被分離對(duì)象相態(tài)或溶劑相和蒸餾液之間分配系數(shù)的不同。該法最簡(jiǎn)單的例子就是用分液漏斗提取法。由于被分離的對(duì)象各不相同，所以提取裝置及方法也不相同。2.溶劑的選擇和回收率在分析工作中常用的溶劑及性質(zhì)列表如下：含乙醇水溶液香料體系（例如香精）的提取，常選擇能區(qū)別乙醇和其它低級(jí)醇的溶劑。有效的溶劑是極性較小的溶劑，如異戊烷、戊烷/二氯甲烷混合物、三氯氟甲烷等溶劑，尤其是三氯氟甲烷用于含醇量高的香精萃取是非常有效的，它幾乎不提取醇類(lèi)物質(zhì)（甲、乙醇）。另外，已腈較適合于提取脂肪含量高的產(chǎn)品揮發(fā)性香味成分。對(duì)一個(gè)體系究竟選用何種溶劑進(jìn)行提取原則上應(yīng)把握以下幾點(diǎn)：第一，對(duì)感興趣的物質(zhì)有較大的分配系數(shù)，（可根據(jù)相似相溶原理考慮）；第二，香味成分與溶劑物理性質(zhì)上易于分開(kāi)。極性大小例如極性小的用烷烴，極性大的用醚、醇類(lèi)。3.

直接萃取技術(shù)固體樣品分析的萃取可采用索氏提取器提取法液態(tài)樣品提取最簡(jiǎn)單方法是分液漏斗中搖動(dòng)、分層分離。但更多采取連續(xù)萃取的方法，這里有兩種裝置，一種用于分離比水重的溶劑提取，另一種用于比水輕的溶劑提取。4、同時(shí)蒸餾—萃取技術(shù)同時(shí)蒸餾萃取也稱(chēng)共蒸萃取（SDE）其方法及原理用圖講解。此法早期用于酒花、胡蘿卜、鐘椒、蕃茄、橄欖油、土豆條、花生、蘑菇和堅(jiān)果的揮發(fā)性物質(zhì)?，F(xiàn)在用途越來(lái)越廣泛，我們已用于煙草香味分析，優(yōu)點(diǎn)是樣品用量少，GC圖形好，易定量化。缺點(diǎn)是含香物質(zhì)可能長(zhǎng)期受熱化學(xué)成分變化。（1）

設(shè)備圖（2）

原理（3）

優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)5、

超臨界CO2流提取技術(shù)。6、固相微萃取技術(shù)（SPME）固相微萃器是一種仿制注射裝置，其注射頭采用多孔高聚物阱的熱解吸作用原理，對(duì)揮發(fā)性香味物質(zhì)進(jìn)行提取，然后進(jìn)行鑒定。該方法目前已開(kāi)始在卷煙香味成分分析中應(yīng)用，適合于定性、定量不夠準(zhǔn)確。有人利用裂解裝置與GC-MS或GC聯(lián)接，在瞬間高溫條件下，將揮發(fā)性成分蒸發(fā)出來(lái)，進(jìn)入GC分離鑒定，或GC-MS分離鑒定。優(yōu)點(diǎn)：快速，樣品量少。缺點(diǎn)：在高溫條件下某些物質(zhì)可能發(fā)生化學(xué)變化或作用。7、閃蒸法8、選擇萃取技術(shù)這種方法是兼有離析法和分離法的特征，下表為能有選擇性萃取帶有酸性或堿性物質(zhì)成分的常用提取劑。10%Na2CO3羧酸5%NaOHKOH酚、內(nèi)酯5%H2SO4堿性成分

例1：梔子花凈油分析桅子花凈油中分離堿類(lèi)、酚類(lèi)、酸類(lèi)、內(nèi)酯及一個(gè)中性成分。例2格蓬香脂油的分析格蓬香脂油中分離和鑒定了3個(gè)烷基吡嗪（0.1NHCl）和5個(gè)甲氧基烷基吡嗪（0.25NHCl）。例3煙草成分的酸、中、堿性成分分離B4F烤煙提酸物提取5%H2SO4水層有機(jī)層水層有機(jī)層(25類(lèi))NaOH水層有機(jī)層（有機(jī)酸）（三）氣相分離技術(shù)1.

平衡液面上空間取樣分離方法此方法是早期分析平衡氣相的經(jīng)典方法，其中吸氣法和通氣法要涉及用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行收集，其收集方法有冷凍、吸附。直接取樣吸氣法通氣法2.固體樣品揮發(fā)物的直接收集該類(lèi)方法一般采用將被分析對(duì)象（植物材料、商業(yè)產(chǎn)品等）在惰性氣體流中加熱，逸出的揮發(fā)性組分用多種方法收集及分析。它不同于液面平衡方法。例如：為測(cè)定烘絲中香氣揮發(fā)情況變化，可采取下圖方法分離煙絲N2heat冷阱1冷阱2活性碳等吸附3.

頂空分析技術(shù)頂空分析是一種分析氣相物的好方法?，F(xiàn)已發(fā)展起來(lái)有頂空分析儀。其原理是測(cè)定分析對(duì)象（液和固）在密閉體系中兩相平衡時(shí)揮發(fā)性成分。下面一圖是頂空分析儀下面一圖是關(guān)系原理圖（四）色譜分離方法

1.色譜分離方法香料工業(yè)也是應(yīng)用氣相色譜的先驅(qū)之一，至今在此行業(yè)仍發(fā)揮著重要作用。幾乎所有現(xiàn)今流行的香味成分都用GC或GC的某種應(yīng)用形式進(jìn)行分析，GC除了廣泛應(yīng)用之外，它還是快速靈敏的分離方法，并且具有令人滿意的定量準(zhǔn)確度和高分辯力。這里不再講GC的原理和儀器，現(xiàn)在發(fā)展已是相當(dāng)高的自動(dòng)化程度，HP6890Plus等儀器。這里要注意結(jié)合香味分析如何選擇柱子問(wèn)題。色譜柱是分離的關(guān)鍵因素之一，色譜柱現(xiàn)在主要有兩種類(lèi)型，一種是填充柱；另一種是毛細(xì)柱，作為柱子內(nèi)的GC液相有兩類(lèi)在分析香味成分時(shí)得到公認(rèn)。一類(lèi)為標(biāo)準(zhǔn)極性液相Carbowax20m，屬聚乙二醇類(lèi)；另一類(lèi)為標(biāo)準(zhǔn)非極性液相SE-30，一種甲基硅酮物質(zhì)。(1)

填充柱典型的氣相色譜填充柱是一根1/4”或1/8”O(jiān)D×8或10的不銹鋼管，里面裝10%的SE-30或Carbowax20M的80-100目ChromosorbWHP載體。雖然不銹鋼管對(duì)絕大數(shù)香味分析是合適的，但是現(xiàn)在有許多實(shí)驗(yàn)室改用玻璃管填定柱，后者一般表現(xiàn)較好的分離效果，并且很可能較少引起拖尾和分解。（2）毛細(xì)管柱毛細(xì)管（或開(kāi)口管）柱的使用是為了提高分辯率，高分辯率對(duì)于組成香料的復(fù)雜混合物的分離是很重要的。早期由于不銹鋼毛細(xì)金屬表面有強(qiáng)的吸附和催化活性，使得許多香味成分分解或拖尾。因?yàn)椴Ａ?xì)管柱有較大的惰性和較高的分離效率，所以現(xiàn)在實(shí)現(xiàn)上已取代了金屬做的毛細(xì)管?，F(xiàn)在又出現(xiàn)了用純?nèi)廴诙趸枳龅闹樱谥亩栊?、效率和壽命等方面都比玻璃毛?xì)管優(yōu)越。（金屬元素在毛細(xì)管柱上的存在多少是造成柱內(nèi)液相和樣品分解的原因。（3）柱的選擇面對(duì)著一大批可用的GC柱型，我們工作中必須選擇那些最適合于進(jìn)行各種工作的柱子。下表所列為柱容量和要求的分離能力和幾種典型的GC應(yīng)用而進(jìn)行推薦的主要標(biāo)準(zhǔn)。

1=小孔徑（0.2-0.3mmID）玻璃或熔融SO2毛細(xì)管柱2=寬孔徑（0.35-0.7mmID）玻璃毛細(xì)管3=填充柱（不銹鋼或玻璃，10%固定相涂在擔(dān)體上）上面的選擇對(duì)于分析香味成分是非常有用的，具體選何種柱子，可根據(jù)分析對(duì)象情況，研究目的進(jìn)行選擇，對(duì)于柱子生產(chǎn)商提供的有關(guān)手冊(cè)，也是分析工作者常用的工具書(shū)。（4）制備氣相色譜法由于制備氣相色譜法可以使用較大容量的柱子并且注射較多的試樣，所以可用來(lái)純化和收集個(gè)別組分或在較精細(xì)的分析前進(jìn)行預(yù)分離。常用的有高效率和可靠性的填充柱是Carbwovx20M—一種極性柱子，也可用寬孔經(jīng)玻璃毛細(xì)管柱，其由液相一般為高效的制備GC技術(shù)曾應(yīng)用于煙草濃縮物的分析，由此分析出81種新的煙草成分并作出了鑒定（DemoleE.andBerthetD.Hellv.Chim.Acta55(6)，1972：1866）2.

柱色譜法（1）分級(jí)分離法濕法填柱，用溶劑洗脫，根據(jù)工作需要可進(jìn)行分段洗脫，得到不同的餾分或組分，接下來(lái)再進(jìn)行分析鑒定。例如，硅膠柱，乙醚在戊烷中含量逐漸增加，進(jìn)行分級(jí)洗脫，可以分段地分離各類(lèi)成分。（2）干柱色譜法在這一方法中，大多數(shù)組分不是通過(guò)柱洗脫，而是將填料移出按吸附層切割成段并用極性溶劑萃取。（3）銀化色譜法該法是為了從不飽和化合物中分離出飽和化合物或不飽和物中分離幾何何異構(gòu)體。這種方法要求要么吸附劑中含有銀鹽要么洗脫劑中含有銀鹽。3.

薄層色譜法（TLC）薄層色譜法是快速、便宜及簡(jiǎn)單的技術(shù)，作為篩選工具特別有價(jià)值。一般制法及分析用途。4.

高性能液相色譜法（HPLC）對(duì)于分析分子量較大的物質(zhì)、許多天然提取物中揮發(fā)性小的組分及熱不穩(wěn)定的物質(zhì)，氣相色譜是無(wú)能為力的，而HPLC卻特別有效。HPLC具有定量、快速自動(dòng)化等多方優(yōu)點(diǎn)。（1）裝置A.溶劑貯槽B.過(guò)濾器C.液體泵D.溶劑程序器E.壓力表F.注射系統(tǒng)G.分離柱H.檢測(cè)器I.記錄儀J.組分收集器下圖是液相色譜主要部分示意圖泵的要求比較嚴(yán)格，因?yàn)橐诟叩墓ぷ鲏毫ο卤３至鲃?dòng)相有穩(wěn)定的且無(wú)脈沖的流速。在現(xiàn)代儀器設(shè)備中常用的泵主要有兩種類(lèi)型：連續(xù)輸液系統(tǒng)和活塞泵。連續(xù)輸液系統(tǒng)裝有一個(gè)柱塞桿，用準(zhǔn)確調(diào)節(jié)好的驅(qū)使其在活塞筒中下行。使流動(dòng)相在非常穩(wěn)定的流速下輸送，完全避免了脈沖。而活塞泵的脈沖在現(xiàn)代泵中已降至最小。柱子類(lèi)型。液相色譜有四種基本類(lèi)型，它們中每一種都需要有自己特定的柱料：（I）吸附色譜：填料為固體顆粒，例如：應(yīng)用直徑大約為10微米（μm）的硅膠或涂有一層硅膠層的玻璃珠（薄殼填料），這種玻璃珠的直徑一般為幾十微米（μ）這種柱子一般很少用梯度洗脫。（II）液液分配色譜：和氣相色譜一樣，填料是由固體載體和一層液體固定相組成。流動(dòng)相是溶劑。固定相有可能被流動(dòng)相溶解。因此，近年來(lái)最常用的固定相是以化學(xué)鍵與載體結(jié)合在一起的固定相。不然就在分離柱前加一根小的飽和柱，目的是使流動(dòng)相為固定相所飽和。（III）離子交換色譜：陰離子或陰離子交換劑經(jīng)常以化學(xué)鍵結(jié)合在支持劑，常用來(lái)作為離子化合物的分離。（IV）排阻色譜：填料的選用能按分子大小進(jìn)行分離，也就是說(shuō)對(duì)分子形狀相似的化合物按分子量的大小不同加以分離。用這種柱子的分析方法常稱(chēng)篩析色譜法（SEC），這種方法在分析polymer方面常常有用?？傊瑢?duì)分析來(lái)講，可以選用10-60米cm長(zhǎng)，0.2-1.0cn直徑，塔板數(shù)為100-10000塊/米的柱子即可。注射系統(tǒng)和檢測(cè)器

常用的檢測(cè)器有兩種，一類(lèi)為通用檢測(cè)器，對(duì)柱子流出液中任何一種化合物產(chǎn)生的或大或小的效應(yīng)都能響應(yīng)；另一種為特定檢測(cè)器，它只對(duì)有限數(shù)目的化合物的物理性質(zhì)所引起的效應(yīng)產(chǎn)生響應(yīng)。

在通用檢測(cè)器中，最常用的是折射率（RI）檢測(cè)器，它們?cè)硎歉鶕?jù)純流動(dòng)相的折射率連續(xù)測(cè)定洗脫液的折射率，有10-7RI單位的差別即可檢出，通常相應(yīng)物質(zhì)的量為1μg數(shù)量級(jí)，但不特別靈敏。另一個(gè)是移動(dòng)絲檢測(cè)器，這種檢測(cè)器利用一根金屬絲將小量流出液移入溶劑蒸發(fā)室。除去溶劑后的組分轉(zhuǎn)到副反應(yīng)室，經(jīng)過(guò)催化轉(zhuǎn)化為甲烷，最后通過(guò)氣相色譜那樣的火焰電離散檢測(cè)器加以檢測(cè)。

在特定檢測(cè)器一類(lèi)中，UV檢測(cè)器為常用的一類(lèi)。最簡(jiǎn)單的檢測(cè)器波長(zhǎng)定在254nm處，較先進(jìn)的其波長(zhǎng)可在200-700nm之間調(diào)節(jié)；對(duì)有紫外吸收的化合物，靈敏度較高，例如對(duì)ε=104的化合物，1μg的量就檢出。該類(lèi)檢測(cè)器中，其它的檢測(cè)器還有熒光檢測(cè)器，質(zhì)譜檢測(cè)器（LC/MSD法）。（2）應(yīng)用例子（I）煙氣中稠環(huán)芳烴測(cè)定（II）分析銀白金合歡凈油中的二個(gè)試樣（III）其它方面：氨基酸、蛋白質(zhì)、肽、分子量較大的色素。煙氣中稠環(huán)芳烴測(cè)定

分析銀白金合歡凈油中

的二個(gè)試樣

三

鑒定技術(shù)（一）GC的鑒定方法1.保留指數(shù)我們知道，香味成分的分析具有較復(fù)雜性質(zhì)，所以，通常采用程序升溫氣相色譜進(jìn)行分析，為了準(zhǔn)確比較保留指數(shù)，有必要把原先的等溫保留指數(shù)體系（Kovats,1958）推廣應(yīng)用到程序升溫程序中（VandenDollandKrat,1963）。在香味分析中廣泛使用的保留指數(shù)是根據(jù)是VandenDoll及Krat修改的在兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物之間的線性?xún)?nèi)插法。使用的標(biāo)準(zhǔn)物是直鍵的脂肪酸乙酯，保留指數(shù)為IE。式中：n=作為參考酯的脂肪酸部分碳數(shù)i=兩個(gè)后續(xù)的參考酯之間碳數(shù)的增量t=各個(gè)峰的保留時(shí)間下圖表示典型的保留指數(shù)測(cè)定，用一系列乙酯作單一的組分，IE用下面方程式來(lái)計(jì)算。

程序升溫的線性指數(shù)體系的準(zhǔn)確度和重復(fù)性雖不像等溫體系那樣好，但作為一種鑒定工具是毫無(wú)疑問(wèn)的。分析作者可查閱有關(guān)香味成分的Kovats指數(shù)和色譜數(shù)據(jù)正確是相當(dāng)有用的。2、GC方法應(yīng)用（二）GC-MS法該法原理是先用氣相色譜分離，后用MS檢測(cè)器檢測(cè)。該法鑒定是采用MS鑒定法。然而，即使是使用GC/MS，常常也需要進(jìn)行復(fù)雜混合物的分組，因?yàn)楹哿炕衔镄枰M(jìn)行濃縮并要與主要的干擾化合物分離，另外還需在兩個(gè)有不同固定相的柱子上進(jìn)行分離，不然就會(huì)得到混合圖譜，不可能有滿意的解析。（1）GC-MS法的工作原理先看圖4-5氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用框圖再看分子分離器工作原理圖4-6

（2）方法和應(yīng)用關(guān)于GC-MS在香氣研究中的應(yīng)用有兩種不同的目的：第一，研究者一般可能對(duì)產(chǎn)品中些對(duì)產(chǎn)品香氣有貢獻(xiàn)的化合物的結(jié)構(gòu)鑒定感興趣；第二，研究者可能要測(cè)定并證明一個(gè)特定的已確定了的化合物或一組化合物的結(jié)構(gòu)。由于計(jì)算機(jī)及標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖在GC-MS分析方法中的應(yīng)用，使得該法是一種較為方便、快捷分析香味成的方法。GC-MS的分析結(jié)果一個(gè)是總離子流圖，另一個(gè)是質(zhì)譜圖分別存于計(jì)算機(jī)中，通過(guò)計(jì)算機(jī)的操作就可以得分析判別的結(jié)果，例如有人分析茉莉精油，從計(jì)算機(jī)上查離子流圖共有175種以上成分，對(duì)每個(gè)成分均可找出其質(zhì)譜圖，例如83號(hào)峰，經(jīng)與電腦數(shù)據(jù)庫(kù)比較可以確定該物質(zhì)為順式茉莉酮。這樣的例子很多，關(guān)鍵是側(cè)重何類(lèi)成分，選用何種分離方法及柱子，預(yù)處理如何等。（三）GC-FTIR法紅外吸收光譜測(cè)定法得到廣泛應(yīng)用是因?yàn)樗腥缦鹿δ埽海?）它是