第二十章 煙草特征呈味成分的鑒定及分析方法

第二十章煙草特征呈味成分的鑒定及分析方法前言

我今天要給大家講課的內容不僅涉及煙草香味成分的分析，而且涉及天然及合成香料以及香精的分析。今天的內容主要是面上的，如果涉及較深入或具體的內容我們可以留待以后分出若干課題來共同探討，例如涉及GC-MS測定方法、涉及LC-MS分析方法以及NMR、X-射線衍射等等，也可分別請國內外專家來講。我今天講的盡可能面上都講到，達到拋磚引玉的作用及目的。關于香氣成分的分析我想分成以下三個大方面給予介紹

取樣

分離的方法

鑒定的方法一、取樣取樣是確保分析結果的準確性及代表性最關鍵步驟之一。在香味物質分析時，仔細地將所取樣品與參照標準品的香氣進行比較是必須的，還應經(jīng)常注意可能出現(xiàn)的各種問題。香料取樣存在的問題例子包括：（1）二相或多相：在桶里或其它容器中的水或固體物的存在。（2）不均勻性：例如常見的沒藥或乳香這樣一類粗樹膠，它們是由不規(guī)則的塊狀固體組成的。

（3）浸膏香脂則是一類粘滯的半固體的物料，它們的取樣應予注意。取樣方法可參見[Kolthoff,I.M.,andElving,P.J.,eds.(1978)的書“TreatiseonAnalyticalChemistry”Parti.Zeded.,Vol.IWiley,NewYork]或其它國內外有關書籍。

取樣應根據(jù)研究目的、也應根據(jù)分析對象的狀態(tài)加以考慮。例如：煙草烘絲過程中的香氣損失或變化可考慮對氣態(tài)的取樣。二、分離方法

在許多情況下（包括濃的香精、香基、精油及化學品），對試樣沒有必要進行分離或濃縮就可以直接進行分析。而在更多的情況下，要對香氣成分進行分析就必須從試樣中分離出我們所要研究的組分。通常先做一些小試管量的試驗或其它小試驗有助于選擇合適的分離技術。同時，在一些試驗中，注意觀察香氣的持久性、穩(wěn)定性、及揮發(fā)性和功能性的變化。這樣分析工作者就可以初步?jīng)Q定對香氣分析是按常規(guī)方法，還是應用比較特殊的方法。對方法的選擇，主要考慮將要分析的范圍，所希望得到的分析內容以及加香對象或基質、介質的特性。（一）蒸餾技術所有的蒸餾方法、目的均為使分析對象的揮發(fā)性組分與非揮發(fā)性組分或揮發(fā)性較低的組分分離開。與提取法相比，優(yōu)點是：沒有非揮發(fā)性成分存在，不會干擾其后的色譜分析；缺點是蒸餾后若得到的是稀水溶液，則需要增加一個分離步驟，把揮發(fā)物分離出來。（我們在同樣條件下曾做過對比分析，其色譜峰形明顯不同）。1.水蒸汽蒸餾可分為常壓和減壓兩各種類型?；驹眍愃朴诨瘜W分析中煙堿分析中的水汽蒸餾?，F(xiàn)設計有不同的小型裝置2.分餾根據(jù)沸點不同，用經(jīng)典填充柱和高回流比的分流操作，經(jīng)常能夠完成必要的分離。由于柱滯留容積相當大，在試樣量較小時此法不宜使用。此法適合于對熱穩(wěn)定性強且有足夠量的物質分離，例如可將30磅綠葉油分離成4個主要餾分，其中各個餾分再分別用不同方法分離處理，鑒定出香味成分。3.高真空蒸餾此方法適用于從非揮發(fā)油中分離出少量揮發(fā)物，也適用于分離食品或煙草等體系揮發(fā)性物質，所要達到的真空度要看分離對象中是否有水，當無水時，此法真空度可達10-3mmHg(0.133pa)或更低，此時是分子蒸餾，當有少量水存在時，可實現(xiàn)高真空蒸餾。此圖是一種高真空蒸餾系統(tǒng)草圖，此方法分離香味成分體系中不會產(chǎn)生新化合物。4.分子蒸餾所謂分子蒸餾，也就是在蒸餾中被蒸餾分子從液體表面蒸發(fā)到被冷凝下來的冷卻表面之間的距離小于分子的“平均自由行程”的蒸餾。要實現(xiàn)分子蒸餾有兩個條件：第一，蒸發(fā)面到冷卻面之間盡可能有小的間距；第二，體系要有較低的壓力（10-3mmHg柱，0.133Pa）。一般有兩種蒸餾裝置可進行分子蒸餾，一種是流動薄膜蒸餾鍋，另一種是鍋式蒸餾鍋。前者適用于處理大量的分離對象（0.1-2L），后者適合于小量分離體系(0.01-0.1L)。(二)提取1.原理該方法原理是基于香味成分在溶劑相和被分離對象相態(tài)或溶劑相和蒸餾液之間分配系數(shù)的不同。該法最簡單的例子就是用分液漏斗提取法。由于被分離的對象各不相同，所以提取裝置及方法也不相同。2.溶劑的選擇和回收率在分析工作中常用的溶劑及性質列表如下：含乙醇水溶液香料體系（例如香精）的提取，常選擇能區(qū)別乙醇和其它低級醇的溶劑。有效的溶劑是極性較小的溶劑，如異戊烷、戊烷/二氯甲烷混合物、三氯氟甲烷等溶劑，尤其是三氯氟甲烷用于含醇量高的香精萃取是非常有效的，它幾乎不提取醇類物質（甲、乙醇）。另外，已腈較適合于提取脂肪含量高的產(chǎn)品揮發(fā)性香味成分。對一個體系究竟選用何種溶劑進行提取原則上應把握以下幾點：第一，對感興趣的物質有較大的分配系數(shù)，（可根據(jù)相似相溶原理考慮）；第二，香味成分與溶劑物理性質上易于分開。極性大小例如極性小的用烷烴，極性大的用醚、醇類。3.

直接萃取技術固體樣品分析的萃取可采用索氏提取器提取法液態(tài)樣品提取最簡單方法是分液漏斗中搖動、分層分離。但更多采取連續(xù)萃取的方法，這里有兩種裝置，一種用于分離比水重的溶劑提取，另一種用于比水輕的溶劑提取。4、同時蒸餾—萃取技術同時蒸餾萃取也稱共蒸萃?。⊿DE）其方法及原理用圖講解。此法早期用于酒花、胡蘿卜、鐘椒、蕃茄、橄欖油、土豆條、花生、蘑菇和堅果的揮發(fā)性物質。現(xiàn)在用途越來越廣泛，我們已用于煙草香味分析，優(yōu)點是樣品用量少，GC圖形好，易定量化。缺點是含香物質可能長期受熱化學成分變化。（1）

設備圖（2）

原理（3）

優(yōu)點、缺點5、

超臨界CO2流提取技術。6、固相微萃取技術（SPME）固相微萃器是一種仿制注射裝置，其注射頭采用多孔高聚物阱的熱解吸作用原理，對揮發(fā)性香味物質進行提取，然后進行鑒定。該方法目前已開始在卷煙香味成分分析中應用，適合于定性、定量不夠準確。有人利用裂解裝置與GC-MS或GC聯(lián)接，在瞬間高溫條件下，將揮發(fā)性成分蒸發(fā)出來，進入GC分離鑒定，或GC-MS分離鑒定。優(yōu)點：快速，樣品量少。缺點：在高溫條件下某些物質可能發(fā)生化學變化或作用。7、閃蒸法8、選擇萃取技術這種方法是兼有離析法和分離法的特征，下表為能有選擇性萃取帶有酸性或堿性物質成分的常用提取劑。10%Na2CO3羧酸5%NaOHKOH酚、內酯5%H2SO4堿性成分

例1：梔子花凈油分析桅子花凈油中分離堿類、酚類、酸類、內酯及一個中性成分。例2格蓬香脂油的分析格蓬香脂油中分離和鑒定了3個烷基吡嗪（0.1NHCl）和5個甲氧基烷基吡嗪（0.25NHCl）。例3煙草成分的酸、中、堿性成分分離B4F烤煙提酸物提取5%H2SO4水層有機層水層有機層(25類)NaOH水層有機層（有機酸）（三）氣相分離技術1.

平衡液面上空間取樣分離方法此方法是早期分析平衡氣相的經(jīng)典方法，其中吸氣法和通氣法要涉及用適當?shù)姆椒ㄟM行收集，其收集方法有冷凍、吸附。直接取樣吸氣法通氣法2.固體樣品揮發(fā)物的直接收集該類方法一般采用將被分析對象（植物材料、商業(yè)產(chǎn)品等）在惰性氣體流中加熱，逸出的揮發(fā)性組分用多種方法收集及分析。它不同于液面平衡方法。例如：為測定烘絲中香氣揮發(fā)情況變化，可采取下圖方法分離煙絲N2heat冷阱1冷阱2活性碳等吸附3.

頂空分析技術頂空分析是一種分析氣相物的好方法。現(xiàn)已發(fā)展起來有頂空分析儀。其原理是測定分析對象（液和固）在密閉體系中兩相平衡時揮發(fā)性成分。下面一圖是頂空分析儀下面一圖是關系原理圖（四）色譜分離方法

1.色譜分離方法香料工業(yè)也是應用氣相色譜的先驅之一，至今在此行業(yè)仍發(fā)揮著重要作用。幾乎所有現(xiàn)今流行的香味成分都用GC或GC的某種應用形式進行分析，GC除了廣泛應用之外，它還是快速靈敏的分離方法，并且具有令人滿意的定量準確度和高分辯力。這里不再講GC的原理和儀器，現(xiàn)在發(fā)展已是相當高的自動化程度，HP6890Plus等儀器。這里要注意結合香味分析如何選擇柱子問題。色譜柱是分離的關鍵因素之一，色譜柱現(xiàn)在主要有兩種類型，一種是填充柱；另一種是毛細柱，作為柱子內的GC液相有兩類在分析香味成分時得到公認。一類為標準極性液相Carbowax20m，屬聚乙二醇類；另一類為標準非極性液相SE-30，一種甲基硅酮物質。(1)

填充柱典型的氣相色譜填充柱是一根1/4”或1/8”O(jiān)D×8或10的不銹鋼管，里面裝10%的SE-30或Carbowax20M的80-100目ChromosorbWHP載體。雖然不銹鋼管對絕大數(shù)香味分析是合適的，但是現(xiàn)在有許多實驗室改用玻璃管填定柱，后者一般表現(xiàn)較好的分離效果，并且很可能較少引起拖尾和分解。（2）毛細管柱毛細管（或開口管）柱的使用是為了提高分辯率，高分辯率對于組成香料的復雜混合物的分離是很重要的。早期由于不銹鋼毛細金屬表面有強的吸附和催化活性，使得許多香味成分分解或拖尾。因為玻璃毛細管柱有較大的惰性和較高的分離效率，所以現(xiàn)在實現(xiàn)上已取代了金屬做的毛細管?，F(xiàn)在又出現(xiàn)了用純熔融二氧化硅做的柱子，在柱的惰性、效率和壽命等方面都比玻璃毛細管優(yōu)越。（金屬元素在毛細管柱上的存在多少是造成柱內液相和樣品分解的原因。（3）柱的選擇面對著一大批可用的GC柱型，我們工作中必須選擇那些最適合于進行各種工作的柱子。下表所列為柱容量和要求的分離能力和幾種典型的GC應用而進行推薦的主要標準。

1=小孔徑（0.2-0.3mmID）玻璃或熔融SO2毛細管柱2=寬孔徑（0.35-0.7mmID）玻璃毛細管3=填充柱（不銹鋼或玻璃，10%固定相涂在擔體上）上面的選擇對于分析香味成分是非常有用的，具體選何種柱子，可根據(jù)分析對象情況，研究目的進行選擇，對于柱子生產(chǎn)商提供的有關手冊，也是分析工作者常用的工具書。（4）制備氣相色譜法由于制備氣相色譜法可以使用較大容量的柱子并且注射較多的試樣，所以可用來純化和收集個別組分或在較精細的分析前進行預分離。常用的有高效率和可靠性的填充柱是Carbwovx20M—一種極性柱子，也可用寬孔經(jīng)玻璃毛細管柱，其由液相一般為高效的制備GC技術曾應用于煙草濃縮物的分析，由此分析出81種新的煙草成分并作出了鑒定（DemoleE.andBerthetD.Hellv.Chim.Acta55(6)，1972：1866）2.

柱色譜法（1）分級分離法濕法填柱，用溶劑洗脫，根據(jù)工作需要可進行分段洗脫，得到不同的餾分或組分，接下來再進行分析鑒定。例如，硅膠柱，乙醚在戊烷中含量逐漸增加，進行分級洗脫，可以分段地分離各類成分。（2）干柱色譜法在這一方法中，大多數(shù)組分不是通過柱洗脫，而是將填料移出按吸附層切割成段并用極性溶劑萃取。（3）銀化色譜法該法是為了從不飽和化合物中分離出飽和化合物或不飽和物中分離幾何何異構體。這種方法要求要么吸附劑中含有銀鹽要么洗脫劑中含有銀鹽。3.

薄層色譜法（TLC）薄層色譜法是快速、便宜及簡單的技術，作為篩選工具特別有價值。一般制法及分析用途。4.

高性能液相色譜法（HPLC）對于分析分子量較大的物質、許多天然提取物中揮發(fā)性小的組分及熱不穩(wěn)定的物質，氣相色譜是無能為力的，而HPLC卻特別有效。HPLC具有定量、快速自動化等多方優(yōu)點。（1）裝置A.溶劑貯槽B.過濾器C.液體泵D.溶劑程序器E.壓力表F.注射系統(tǒng)G.分離柱H.檢測器I.記錄儀J.組分收集器下圖是液相色譜主要部分示意圖泵的要求比較嚴格，因為要在高的工作壓力下保持流動相有穩(wěn)定的且無脈沖的流速。在現(xiàn)代儀器設備中常用的泵主要有兩種類型：連續(xù)輸液系統(tǒng)和活塞泵。連續(xù)輸液系統(tǒng)裝有一個柱塞桿，用準確調節(jié)好的驅使其在活塞筒中下行。使流動相在非常穩(wěn)定的流速下輸送，完全避免了脈沖。而活塞泵的脈沖在現(xiàn)代泵中已降至最小。柱子類型。液相色譜有四種基本類型，它們中每一種都需要有自己特定的柱料：（I）吸附色譜：填料為固體顆粒，例如：應用直徑大約為10微米（μm）的硅膠或涂有一層硅膠層的玻璃珠（薄殼填料），這種玻璃珠的直徑一般為幾十微米（μ）這種柱子一般很少用梯度洗脫。（II）液液分配色譜：和氣相色譜一樣，填料是由固體載體和一層液體固定相組成。流動相是溶劑。固定相有可能被流動相溶解。因此，近年來最常用的固定相是以化學鍵與載體結合在一起的固定相。不然就在分離柱前加一根小的飽和柱，目的是使流動相為固定相所飽和。（III）離子交換色譜：陰離子或陰離子交換劑經(jīng)常以化學鍵結合在支持劑，常用來作為離子化合物的分離。（IV）排阻色譜：填料的選用能按分子大小進行分離，也就是說對分子形狀相似的化合物按分子量的大小不同加以分離。用這種柱子的分析方法常稱篩析色譜法（SEC），這種方法在分析polymer方面常常有用?？傊?，對分析來講，可以選用10-60米cm長，0.2-1.0cn直徑，塔板數(shù)為100-10000塊/米的柱子即可。注射系統(tǒng)和檢測器

常用的檢測器有兩種，一類為通用檢測器，對柱子流出液中任何一種化合物產(chǎn)生的或大或小的效應都能響應；另一種為特定檢測器，它只對有限數(shù)目的化合物的物理性質所引起的效應產(chǎn)生響應。

在通用檢測器中，最常用的是折射率（RI）檢測器，它們原理是根據(jù)純流動相的折射率連續(xù)測定洗脫液的折射率，有10-7RI單位的差別即可檢出，通常相應物質的量為1μg數(shù)量級，但不特別靈敏。另一個是移動絲檢測器，這種檢測器利用一根金屬絲將小量流出液移入溶劑蒸發(fā)室。除去溶劑后的組分轉到副反應室，經(jīng)過催化轉化為甲烷，最后通過氣相色譜那樣的火焰電離散檢測器加以檢測。

在特定檢測器一類中，UV檢測器為常用的一類。最簡單的檢測器波長定在254nm處，較先進的其波長可在200-700nm之間調節(jié)；對有紫外吸收的化合物，靈敏度較高，例如對ε=104的化合物，1μg的量就檢出。該類檢測器中，其它的檢測器還有熒光檢測器，質譜檢測器（LC/MSD法）。（2）應用例子（I）煙氣中稠環(huán)芳烴測定（II）分析銀白金合歡凈油中的二個試樣（III）其它方面：氨基酸、蛋白質、肽、分子量較大的色素。煙氣中稠環(huán)芳烴測定

分析銀白金合歡凈油中

的二個試樣

三

鑒定技術（一）GC的鑒定方法1.保留指數(shù)我們知道，香味成分的分析具有較復雜性質，所以，通常采用程序升溫氣相色譜進行分析，為了準確比較保留指數(shù)，有必要把原先的等溫保留指數(shù)體系（Kovats,1958）推廣應用到程序升溫程序中（VandenDollandKrat,1963）。在香味分析中廣泛使用的保留指數(shù)是根據(jù)是VandenDoll及Krat修改的在兩個標準物之間的線性內插法。使用的標準物是直鍵的脂肪酸乙酯，保留指數(shù)為IE。式中：n=作為參考酯的脂肪酸部分碳數(shù)i=兩個后續(xù)的參考酯之間碳數(shù)的增量t=各個峰的保留時間下圖表示典型的保留指數(shù)測定，用一系列乙酯作單一的組分，IE用下面方程式來計算。

程序升溫的線性指數(shù)體系的準確度和重復性雖不像等溫體系那樣好，但作為一種鑒定工具是毫無疑問的。分析作者可查閱有關香味成分的Kovats指數(shù)和色譜數(shù)據(jù)正確是相當有用的。2、GC方法應用（二）GC-MS法該法原理是先用氣相色譜分離，后用MS檢測器檢測。該法鑒定是采用MS鑒定法。然而，即使是使用GC/MS，常常也需要進行復雜混合物的分組，因為痕量化合物需要進行濃縮并要與主要的干擾化合物分離，另外還需在兩個有不同固定相的柱子上進行分離，不然就會得到混合圖譜，不可能有滿意的解析。（1）GC-MS法的工作原理先看圖4-5氣相色譜—質譜聯(lián)用框圖再看分子分離器工作原理圖4-6

（2）方法和應用關于GC-MS在香氣研究中的應用有兩種不同的目的：第一，研究者一般可能對產(chǎn)品中些對產(chǎn)品香氣有貢獻的化合物的結構鑒定感興趣；第二，研究者可能要測定并證明一個特定的已確定了的化合物或一組化合物的結構。由于計算機及標準質譜圖在GC-MS分析方法中的應用，使得該法是一種較為方便、快捷分析香味成的方法。GC-MS的分析結果一個是總離子流圖，另一個是質譜圖分別存于計算機中，通過計算機的操作就可以得分析判別的結果，例如有人分析茉莉精油，從計算機上查離子流圖共有175種以上成分，對每個成分均可找出其質譜圖，例如83號峰，經(jīng)與電腦數(shù)據(jù)庫比較可以確定該物質為順式茉莉酮。這樣的例子很多，關鍵是側重何類成分，選用何種分離方法及柱子，預處理如何等。（三）GC-FTIR法紅外吸收光譜測定法得到廣泛應用是因為它有如下功能：（1）它是