熒光原位雜交技術(shù)及其在遺傳學(xué)中的應(yīng)用

熒光原位雜交技術(shù)及其在遺傳學(xué)中的應(yīng)用

fluentifybridization是一種創(chuàng)新技術(shù)，將細(xì)胞遺傳、生物學(xué)和免疫科技細(xì)節(jié)相結(jié)合。用熒光色素標(biāo)記的核電站作為檢測(cè)對(duì)象，按照堿基互用的原則，將檢測(cè)材料中的核酸與特定性質(zhì)結(jié)合起來，形成檢測(cè)到的混合雙鏈核，或?qū)⒑袌?bào)告分子的偶爾原子作為檢測(cè)觸發(fā)點(diǎn)。混合后，用含鋯開發(fā)分析報(bào)告分子的親水或抗體，并對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。本文就FISH技術(shù)在遺傳學(xué)中的應(yīng)用和近年來的進(jìn)展做一簡(jiǎn)單的綜述。1間期細(xì)胞核和損傷的診斷FISH技術(shù)用于遺傳學(xué)各個(gè)領(lǐng)域有著無比的優(yōu)越性:分析方法簡(jiǎn)便迅速、直觀性強(qiáng);既可以檢測(cè)中期分裂相又可以檢測(cè)間期細(xì)胞核;既可以識(shí)別常規(guī)染色體分析不能識(shí)別的標(biāo)記染色體又可以分析一部分顯帶染色體技術(shù)不易分辨的異常,如某些倒位、易位、微小缺失、復(fù)雜畸變等;敏感性和特異性非常高。1.1交技術(shù)發(fā)展的動(dòng)因由于DNA分子在染色體上呈線性排列,因此可以用基因或基因片斷作為探針與染色體標(biāo)本進(jìn)行熒光原位雜交從而將基因定位在染色體上。基因定位是熒光原位雜交技術(shù)在分子細(xì)胞遺傳學(xué)上的最初應(yīng)用,也是熒光原位雜交技術(shù)發(fā)展的原動(dòng)力。該方法克服了傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交定位基因技術(shù)的許多不足之處,能直接定位一個(gè)基因的物理位置,為進(jìn)一步在分子水平上的分析提供一個(gè)參考點(diǎn),FISH能定位小至1kb的DNA片段。有研究利用FISH已將13個(gè)不同的DNA片段定位到了11號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上。用不同顏色熒光素標(biāo)記兩個(gè)不同的DNA鏈,當(dāng)它們?cè)谌旧w上的距離大于1Mbp時(shí),可以依據(jù)不同探針信號(hào)的排列關(guān)系分辨他們?cè)谌旧w上的順序。如果使用間期細(xì)胞,兩個(gè)DNA鏈的距離可以縮短至50kbp,這個(gè)間距是染色體上的分辨距離的1/20。不同探針的次序可以通過測(cè)量其在間期細(xì)胞的距離來確定。以此繪制基因圖譜。1.2fish的檢測(cè)結(jié)果1993年FISH技術(shù)就被美國(guó)遺傳學(xué)會(huì)(ACMG)允許用于產(chǎn)前輔助診斷,而到2000年鑒于FISH技術(shù)具有高度的敏感性和特異性,美國(guó)宣布FISH技術(shù)可以用于常見染色體數(shù)目異常的確診,而不再僅僅作為輔助性產(chǎn)前診斷手段。在2001年TepperbergJ等對(duì)FISH技術(shù)進(jìn)行快速產(chǎn)前診斷的結(jié)果與核型分析結(jié)果進(jìn)行了大樣本比較,共47312份有效標(biāo)本中,FISH法僅有9例出現(xiàn)了假陽(yáng)性結(jié)果,假陽(yáng)性率為0.019%,有32例出現(xiàn)了假陰性結(jié)果,假陰性率為0.049%。此后,FISH技術(shù)在一些發(fā)達(dá)國(guó)家被廣泛用于快速產(chǎn)前診斷。由于13,18及2l號(hào)染色體以及X和Y染色體數(shù)目異常占胎兒染色體異常的65%,占胎兒染色體數(shù)目異常的80%～95%,因此目前FISH方法檢測(cè)試劑盒主要是針對(duì)這5條染色體,檢測(cè)結(jié)果一般可以在24～48h就可以獲得,且檢測(cè)結(jié)果與核型分析結(jié)果的一致性可以達(dá)到99.5%以上。90年代以后,FISH技術(shù)廣泛應(yīng)用于遺傳病的檢測(cè),杜梅君等利用生物素標(biāo)記的X-著絲粒探針、特異區(qū)域單拷貝序列探針21q22.3、地高辛標(biāo)記的重復(fù)序列探針pY3.4通過單色及雙色熒光原位雜交分別對(duì)7例性腺發(fā)育不全、5例唐氏綜合癥患者外周血染色體及間期細(xì)胞進(jìn)行熒光原位雜交(FISH),成功地診斷出21三體;45,XO;46,XX/45,XO;45,XO/47,XXX;46,Xi(Xq);47,XXY等染色體異常的病例。1.3重新確定第1種是多元參與博弈型乳腺癌背景2的基因組織以分子中心,主要分為3-t-3和3號(hào)小體3腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后與染色體的數(shù)量、結(jié)構(gòu)異常密切相關(guān),腫瘤生物學(xué)水平高危因素有DNA錯(cuò)配修復(fù)基因的功能障礙導(dǎo)致的微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性、18q的雜合性丟失、差異表達(dá)等。應(yīng)用FISH能快速準(zhǔn)確地顯示染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常,并利用混合多色探針可檢測(cè)特定染色體易位。對(duì)腫瘤的診斷治療及預(yù)后的判斷又指導(dǎo)意義。2000年,就有文獻(xiàn)報(bào)道使用商業(yè)化探針UroVysis(雅培公司)用于膀胱癌的診斷,靈敏度達(dá)到82.4%,特異度為91.8%。原發(fā)性乳腺癌的雜合性缺失發(fā)生在3p上的3個(gè)位點(diǎn),用3號(hào)染色體著絲粒探針和幾個(gè)特定位點(diǎn)Cosmid或YAC探針檢測(cè)Kaposis肉瘤里3p14-ter區(qū)位點(diǎn)丟失。在原發(fā)性乳腺癌中有20%～30%的人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)基因的擴(kuò)增和蛋白過度表達(dá),HER2過度表達(dá)的乳腺癌浸潤(rùn)性強(qiáng),預(yù)后差。另外,HER2的狀態(tài)是乳腺癌藥物(蒽環(huán)類藥物和曲妥珠單抗)治療的主要參考指標(biāo)。其中曲妥珠單抗(赫賽汀)是一種重組DNA衍生的人源化單克隆抗體,選擇性地作用于HER2的細(xì)胞外部分,適用于治療HER2過度表達(dá)的乳腺癌。由于只有HER2過度表達(dá)或HER2基因擴(kuò)增的乳腺癌患者用赫賽汀治療才有效,因此檢測(cè)HER2的狀態(tài)非常重要。目前主要采用FISH法檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增的水平。由于一些回顧性研究發(fā)現(xiàn)用FISH法預(yù)測(cè)赫賽汀療效好于免疫組化等其他方法,因此,FISH被認(rèn)定為檢測(cè)HER2狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)。血液系統(tǒng)腫瘤患者大多數(shù)有染色體數(shù)目改變,有報(bào)道80%以上的AML有非整倍體,特別是亞二倍體。1991年Kreker等曾應(yīng)用FISH對(duì)3種患者檢查了常規(guī)方法不易發(fā)現(xiàn)的低百分率8號(hào)三體性細(xì)胞和12號(hào)染色體三體,含12號(hào)染色體三體的CLL患者預(yù)后佳。白血病、淋巴瘤都具有特異染色體的易位,而在慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者中,如檢測(cè)到RB1的缺失則提示患者預(yù)后較好,中位生存期可達(dá)到133個(gè)月。2fish技術(shù)的最新2.1熒光原位雜交探針的制備方法早期探針是一段帶有熒光色素或(半)抗原的核酸序列。其長(zhǎng)度介于15至數(shù)千個(gè)核苷酸,但以250～650個(gè)核苷酸的探針雜交效果最好。獲取探針的方法有化學(xué)方法合成探針、克隆法獲取探針、PCR擴(kuò)增獲取探針。探針的標(biāo)記方法有缺口平移法、隨機(jī)引物法、PCR法。寡核苷酸探針、肽核苷酸(PeptideNucleicAcid,PNA)探針是近期發(fā)現(xiàn)的2種新型探針。鑒于它們的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn),有望取代以往的DNA或RNA作為熒光原位雜交探針。下面分別加以敘述。2.1.1ndna檢測(cè)寡核苷酸探針是根據(jù)探針靶序列的堿基順序,用化學(xué)方法合成的單鏈DNA(singlestrandDNA,ssDNA)。其長(zhǎng)度為15～50個(gè)核苷酸,由于分子小,更容易滲透到細(xì)胞的目標(biāo)區(qū)域,但也限制了其所能攜帶的熒光基團(tuán)或報(bào)告分子的數(shù)目,并最終導(dǎo)致雜交后,熒光信號(hào)較弱。因此,這類探針僅適用于對(duì)重復(fù)單位較短的高度重復(fù)序列(如染色體端粒序列)的熒光原位雜交分析。2.1.2pna與dna的雜交PNA寡聚物是一類新型分子,其結(jié)構(gòu)與DNA相似。但在PNA中,沒有核糖-磷酸基骨架,其骨架是不帶電的肽鏈(聚酰胺)。PNA與DNA雜交時(shí),也遵循A-T,C-G堿基配對(duì)原則。與DNA相比,PNA對(duì)熱穩(wěn)定、與DNA的結(jié)合不依賴于離子強(qiáng)度,因此雜交時(shí)受探針變性溫度和溶液pH值的影響較小。但由于PNA探針只能通過化學(xué)方法進(jìn)行合成,而且合成費(fèi)用較高,因此迄今所用的PNA探針還僅限于染色體的泛著絲粒(Pan-centromere)和泛端粒(Pan-telomere)探針。2.2熒光素標(biāo)記探針M-FISH的最大特點(diǎn)是可將多次繁瑣的FISH實(shí)驗(yàn)和多種不同基因的定位在1次FISH實(shí)驗(yàn)中完成。Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰熒光素(AFA)標(biāo)記探針建立了雙色FISH技術(shù)。1990年Nederlof等提出用3種熒光素探測(cè)3種以上的靶位DNA序列,創(chuàng)建了多色FISH方法。以下3種方法是在多彩色FISH基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)。2.2.1染色體與檢測(cè)方法染色體描繪(chromosomepainting)是用全染色體或區(qū)域特異性探針,通過多彩色FISH使中期細(xì)胞特異染色體和間期核呈現(xiàn)不同熒光顏色的條帶,從而分析染色體的方法,常用于識(shí)別染色體重組、斷裂點(diǎn)分布、鑒別染色體外核物質(zhì)的起源。反轉(zhuǎn)染色體描繪(reversechromosomepaint-ing)是用篩選出的畸變?nèi)旧w與正常染色體雜交來分析畸變?nèi)旧w的方法,它不僅能區(qū)分標(biāo)志染色體的來源,而且能分辨間隙易位和復(fù)雜的標(biāo)志染色體。多彩色原位啟動(dòng)標(biāo)記(multicolorprimedinsitulabeling,multicolorPRINS)是用寡核苷酸作為引物,原位PCR擴(kuò)增待測(cè)序列,并在此過程中摻入熒光素直接或間接標(biāo)記的核苷三磷酸,使擴(kuò)增出的序列都得以標(biāo)記。通過幾輪這樣的擴(kuò)增,使待檢的幾個(gè)序列的原位擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)記上不同熒光素,實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多個(gè)微小缺失和突變等染色體微小改變的檢測(cè)。這方法已常規(guī)用于檢測(cè)特異性α衛(wèi)星序列在染色體和間期核內(nèi)的定位。2.2.2內(nèi)鏡染色體同源性比較內(nèi)鏡ch比較基因組雜交(comparativegenomichybridization,CGH)的基本原理是先分離出正常組織和腫瘤組織中的全部DNA,分別用不同熒光素標(biāo)記,如正常DNA標(biāo)以紅色,腫瘤DNA標(biāo)以綠色,把它們混合后,與待檢染色體雜交,若結(jié)果呈黃色即為正常,若呈紅色則說明有染色體缺失,若呈綠色則說明有對(duì)應(yīng)序列的基因擴(kuò)增。與FISH相比,CGH在一次實(shí)驗(yàn)中能對(duì)腫瘤樣品中整個(gè)基因組中的DNA擴(kuò)增和缺失等變異獲得整體認(rèn)識(shí),并描繪出相應(yīng)的CGH核型圖,可在物種間進(jìn)行染色體同源性比較,從而彌補(bǔ)了常規(guī)FISH只適于小部分腫瘤的不足。CGH最適合于檢測(cè)實(shí)體瘤、淋巴瘤等不易得到高質(zhì)量染色體標(biāo)本的疾病。CGH另一無法替代的優(yōu)點(diǎn)是它可在一次雜交中檢測(cè)整個(gè)基因遺傳物質(zhì)的增加或減少,但精度有限,檢測(cè)不出微小的擴(kuò)增或缺失,僅適用微切割(microdissec-tion)和PCR技術(shù)與CGH的結(jié)合使其越來越廣泛地應(yīng)用于多種腫瘤研究。但CGH不能檢測(cè)DNA的結(jié)構(gòu)重排如反轉(zhuǎn)和轉(zhuǎn)座,并且其靈敏度和分辨率都有一定的限制。要對(duì)那些微弱變化進(jìn)行定量分析,高分辨率的顯微裝置和專業(yè)化圖像分析系統(tǒng)對(duì)M-FISH是至關(guān)重要的。2.2.3基于熒光定量成像的染色核型序列光譜染色體自動(dòng)核型分析(spectralkaryotyping,SKY)是一項(xiàng)顯微圖像處理技術(shù),首先由Dr.ThomasRied(NHGRI,NIH,Bethesda,MD)實(shí)驗(yàn)室于1996年發(fā)表在Science(273:494-497)。在染色體核型排序的應(yīng)用上,SKY可同時(shí)分辨人類的22對(duì)染色體及XY性染色體或老鼠的21種不同染色體,并以各種顏色呈現(xiàn)出來。該方法結(jié)合了傅立葉頻譜、電荷耦合設(shè)備成像和光學(xué)顯微方法,同時(shí)計(jì)量樣本在可見光和近紅外范圍內(nèi)所有點(diǎn)的發(fā)射頻譜,因而可以使用多個(gè)熒光染料的頻譜重疊的探針。與一般熒光原位雜交不同的是其同時(shí)使用24種染色體的涂染探針,而雜交的靶DNA可以是疾病標(biāo)本或細(xì)胞系的中期染色體,這一點(diǎn)與比較基因組雜交(CGH)使用正常外周血淋巴細(xì)胞中期染色體不同。2.3第一次檢測(cè)質(zhì)粒的可行性隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,