植物比較制圖的研究進展

植物比較制圖的研究進展

比較脾臟是指使用共同遺傳標記（主要是分子標記、基因克隆和矩陣克?。ο嚓P菌株進行物理或遺傳遷移，并比較這些標記在不同物種的重組中的分布，以顯示同線性或同線性。正確分析不同物種的矩陣結構和矩陣發(fā)育過程?；蚪M比較作圖的研究,不僅揭示了同屬甚至同科物種基因組間的同源性和差異性,對不同物種在起源、演化過程中的變化的研究具有巨大的啟示作用,而且結束了過去植物基因組研究主要由各物種的經(jīng)濟價值而確定的、局限于各個物種的分散研究系統(tǒng),使得不同領域的研究工作得以有機地互相補充,建立跨越物種的大遺傳系統(tǒng)。因此,比較作圖已成為近年來植物基因組學研究的重要內(nèi)容。比較作圖的分子基礎是物種間DNA序列尤其是編碼序列的保守性。水稻、玉米等一些重要的植物的遺傳圖譜和物理圖譜日益趨向高分辨率、高精確度等方面的迅速發(fā)展,為植物比較作圖奠定了重要的基礎。1遺傳手冊和物理手冊1.1dna分子標記的應用遺傳圖譜(geneticmap)是應用雜交育種以及家系分析等遺傳學方法構建的能顯示基因以及其它序列特征在基因組上位置的圖,構建基礎是染色體的交換和重組,遺傳圖距通過重組率進行描述,其單位以厘摩(centi-Morgan,cM)表示,1個遺傳圖距即1個cM,大小為1%的重組率。遺傳圖譜的構建一般采用形態(tài)標記、細胞學標記、生化標記和DNA分子標記等4種遺傳標記。上世紀80年代以前主要采用前三種遺傳標記,所構建的遺傳圖譜也稱經(jīng)典遺傳圖譜。由于這三種標記都是以基因表達的結果為基礎,是對基因的間接反映,從而存在標記數(shù)量小、特殊遺傳材料培育困難等問題,除玉米少數(shù)作物外,大多數(shù)作物并沒有一個完全的遺傳連鎖圖。進入上世紀80年代后,DNA分子標記等分子標記得以廣泛應用,這是由于基因雖然是非常有用的標記,但可用作標記的基因非常有限,而且高等真核生物基因組中存在大量的基因隔離區(qū),純粹用基因作為標記將在遺傳圖中留下大片的無標記區(qū);而DNA分子標記如RFLP、RAPD、SSLP、SNP具有數(shù)量豐富、遺傳穩(wěn)定、不受基因表達與否的限制、不受環(huán)境影響以及共顯性的特點,是在DNA水平上對遺傳變異的直接反映,從而促進遺傳圖譜的構建由經(jīng)典遺傳圖譜時期發(fā)展到以DNA分子標記為主的遺傳圖譜時期,促進了遺傳圖譜向高精確度和高分辨率迅速發(fā)展。此外,分子生物學和基因克隆技術的發(fā)展,使得大量基因和cDNA片段被克隆分離,進一步為遺傳圖譜的構建提供了豐富的材料。以水稻遺傳圖發(fā)展為例,自1988年McCouch等發(fā)展第一張水稻RFLP遺傳圖以來,到1996年水稻遺傳圖DNA標記已增至2300個,其中1800個為從愈傷組織、根以及莖尖中分離的cDNA,標記間平均間距達到300kb。至1998年,Harushima等發(fā)表了包含2275個分子標記的高密度RFLP連鎖圖,這是水稻的第5張遺傳圖譜。日本基因組計劃在此基礎上又發(fā)展了將近1000個新的RFLP標記,于2001年3月在網(wǎng)上公布了包含3267個RFLP標記的高密度水稻分子標記連鎖圖(見http://rgp.DNA.affrc.go.jp),這是迄今為止最新的水稻分子標記連鎖圖。植物遺傳圖譜的高分辨率和高精確度進一步發(fā)展,大大促進了植物物理圖和基因組比較作圖研究。1.2分子標記法remiss物理圖(physicalmap)是采用分子生物學技術直接將DNA分子標記、基因或者克隆標定在基因組實際位置的圖,相對于遺傳圖而言,這一位置是實際的、可測定的,而不是相對的。物理圖有三個重要的用途。第一,根據(jù)遺傳學研究提供的信息,可在物理圖上把基因定位在一定的范圍內(nèi),通過對該范圍內(nèi)DNA片段的確定并結合圖位克隆技術,可達到分離基因的目的:第二,目前基因的物理圖的DNA構成片段一般為1～200kb(如水稻BAC克隆平均長度為120kb),有利于直接測序,從而“拼接”整個基因組的序列,為研究者在核苷酸水平上解開遺傳之謎提供了可能:第三,利用如熒光原位雜交等技術通過對特定DNA序列特別是編碼序列在染色體上的分布位置的研究,對研究基因組進化、起源以及結構和功能方面具有重要的理論意義。物理作圖主要包括四種類型:(1)限制性作圖(restrictionmapping)。利用限制性內(nèi)切酶將染色體切成數(shù)片段,再根據(jù)重疊序列把片段連接成染色體,確定遺傳標志之間的物理距離[堿基對(bp)或千堿基(kb)或兆堿基(Mb)],它可以將限制性酶切位點標定在DNA分子的一定位置上。(2)依靠克隆的作圖(clone-basedmapping)。即根據(jù)克隆的DNA片段之間的重疊順序構建重疊群(contig),繪制重疊克隆的物理連鎖圖。近年來,隨著構建大片段基因文庫技術,如YAC和BAC載體的使用以及越來越多生物遺傳圖譜分辨率和精確度的提高,使得利用重疊克隆群構建物理圖成為可能。利用該技術Wang等用1199個DNA標記篩選出5701個YAC,構建了相應的重疊克隆群,其物理圖譜覆蓋了水稻基因組的50%。Harushima等進一步構建的由2275個YAC克隆組成213個相互交叉重疊群的最新水稻物理圖譜,覆蓋率提高到65%。Rajyashri等利用RFLP標記RG214、RG32還構建了抗稻癭蚊Gm-2的YAC重疊克隆群。但是,由于YAC存在較高的嵌合、重組、缺失現(xiàn)象(Chimerism),BAC在基因組物理圖構建中得到重視,研究者相繼構建了水稻、高粱、擬南芥菜等BAC文庫。根據(jù)研究目的的需要,為了認識水稻染色體亞端粒區(qū)域的組織結構(生物的染色體亞端粒區(qū)域在物種進化過程中是高度活躍的),王文明等構建了水稻第6染色體長臂亞端粒區(qū)的BAC重疊克隆群,對其研究發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在大量的基因編碼區(qū)。近年來,PCR技術的引入,給重疊克隆群的構建帶來了巨大革新,以PCR技術為基礎發(fā)展的一系列技術如STS、RAPD、AFLP以及Alu-PCR等已被廣泛應用于物理圖的構建。2002年4月,在Science上發(fā)表的粳稻和秈稻基因組的草圖序列主要就是在STS技術基礎上完成的。(3)熒光標記原位雜交(fluorescentinsituhybridization,FISH)作圖。將熒光標記的探針與染色體雜交確定分子標記的所在位置,作出探針分子的染色體物理圖。染色體原位雜交技術(insituhybridization,ISH)的興起與發(fā)展推動了物理圖譜的另一個研究方向即細胞遺傳圖的構建,細胞遺傳圖能夠直觀地反映基因或DNA序列在染色體上的分布情況,這對基因間的真實連鎖關系和染色體結構的認識、染色體結構的改造、研究基因結構和功能的關系及基因工程育種、檢查遺傳圖中基因次序與臂區(qū)劃分的準確性都具有很重要的意義。運用該技術,李立家通過分析玉米抗病基因及其它植物抗病基因在玉米染色體上的位置關系發(fā)現(xiàn),抗病基因集中分布于少數(shù)染色體相同臂上,而且排列相對密集,從而推測抗病基因集中排列的傾向很可能由于功能與結構的一致性所決定,它們也許具有某種共同或相似的功能(李立家,1998,武漢大學博士論文)。由于YAC、BAC文庫建立與相應功能基因物理圖譜的構建,大片段YAC與BAC克隆作為染色體原位雜交的探針,使功能基因的染色體定位效率顯著提高,一些重要的功能基因如Xa-21、Pi-5(t)、Glh、RTSV、Gm-2、Bph3等也成功定位到水稻染色體上。利用BAC-FISH,Cheng等成功構建了高密度的水稻第10染色體粗線期物理圖,并確定了該染色體著絲粒的準確位置。(4)順序標簽位點(sequencetaggedsite,STS)作圖。通過PCR或分子雜交將基因組中單一的小片段DNA順序定位在基因組的DNA區(qū)段中。這是目前最有效的物理作圖技術,能對大基因組作出快速的最詳盡圖譜的技術。2單子葉植物帶作模型的研究植物比較作圖(comparativemapping)最早是在雙子葉植物茄科中番茄和馬鈴薯、番茄與土豆以及番茄和胡椒之間進行的。近年來,隨著單子葉植物禾本科作物分子圖的迅速發(fā)展,比較作圖研究尤為引人注目,并取得了很大進展。通過玉米和高梁,小麥、大麥和黑麥,玉米、小麥和水稻,小麥、水稻、玉米和小麥,粟與水稻等的比較基因組研究表明,盡管這些作物親緣關系遠近,基因組大小、染色體數(shù)目各不相同,但比較作圖的結果卻顯示出它們的基因組存在高度的保守性,染色體共線性片段和基因間的同源性廣泛存在。2.1水稻基因在比較遺傳中的應用比較遺傳作圖是利用一個種的基因或者基因的部分片段或者遺傳標記,通過遺傳學的方法在其他的物種中尋找其同源順序及構建相應的遺傳標記圖。1995年,Nagamura等用水稻cDNA標記延伸因子eFF2同源順序(elongationfactoreFF2homologue)對大豆、高粱、擬南薺菜等16種植物進行雜交,結果發(fā)現(xiàn)均存在同源性序列。Devos等進一步研究還發(fā)現(xiàn),水稻中存在與許多擬南芥的同源基因。由于水稻基因組在禾本科植中基因組最小,僅為400Mb,DNA含量僅為0.45pg(單倍體基因組),是遺傳研究中理想的模式植物,已構建了高分辨率的遺傳圖,為其他植物的作圖提供了豐富的探針。因此,以水稻基因作為依據(jù)對包括禾本科植物在內(nèi)的不同種的植物比較作圖,有助于種間分子、遺傳和雜交育種所必須的信息的轉譯,最終建立具有較為廣泛聯(lián)系和適應多種植物的遺傳骨架。比較遺傳作圖還可以了解更多的各種植物中可供利用的遺傳標記,這對遺傳研究較為滯后的植物來說尤其重要,如1994年Jena等構建了栽培稻與藥用野生稻的分子標記比較遺傳圖,用栽培稻的RFLP遺傳標記建立了藥用野生稻的RFLP遺傳圖,這是根據(jù)不同物種間基因組的同線性原理進行的,既有基因組成的依據(jù),又從分子進化角度體現(xiàn)了二者之間的親緣關系,可以說是植物比較作圖的進步。在此原理基礎上,Kennard等也成功地構建出水稻與來源于北美洲的野生稻ZizaniapalustrisL的RFLP的比較遺傳圖,并且發(fā)現(xiàn)在野生稻與栽培稻之間不僅存在著高度保守性,而且在栽培稻11條染色體(第12染色體除外)中還普遍存在著與ZizaniapalustrisL具有共線性的標記。隨著比較作圖的研究不斷深入,植物的比較作圖已經(jīng)發(fā)展到對細胞器中的較小的基因組的分析。最近,Ishii和McCouch對栽培稻、藥用野生稻、澳洲野生稻、小粒野生稻、寬葉野生稻、馬來野生稻、玉米、小麥、高粱、大麥、燕麥和蔗糖等15種禾本科作物的葉綠體基因組的微衛(wèi)星DNA通過設定的引物擴增的結果也表明,在禾本科的葉綠體基因組的微衛(wèi)星DNA中也存在著微同線性。2.2功能基因的分子活性以上綜述的比較圖的報道都是比較遺傳圖,雖然它們也能反映出不同物種在進化中所發(fā)生的易位、重復等遺傳現(xiàn)象,但并不能反映它們在染色體上的真實位置的變化。植物比較物理作圖主要有兩種方法,一是對同源順序的序列分析,通過分析它們的相似性來研究不同物種分子系統(tǒng)進化過程和解讀基因序列;另一種是比較原位雜交定位,這是由于不同物種的同線性片段在染色體上的真實位置、片段間在染色體上距離的遠近、片段分布的染色體區(qū)域(如近著絲粒、臂的中部或端部等)、非同線性片段與同線性片段如何穿插分布以及在細胞水平上種間核型的進化特點等,只有通過染色體比較原位雜交定位才能直觀地闡明,所以比較原位雜交物理作圖已成為植物比較作圖中一個越來越重要的研究領域。以早期的植物的比較原位雜交物理作圖中的rDNA研究為例,1994年,Fukui等用17S-5.8S-25S的RNA基因作為探針對栽培稻及8個野生稻種進行了比較物理定位,結果發(fā)現(xiàn)不僅野生稻種中的rDNA位點數(shù)變異很大,而且來源于不同區(qū)域的栽培稻的rDNA位點數(shù)也存在著一定的變異,Taketa等通過對9個野生大麥的5S和18S-25SrDNA基因的染色體物理定位也發(fā)現(xiàn)了這種變異的存在,他們因此推斷由于環(huán)境選擇的壓力造成了rDNA位點在數(shù)量及染色體位置上的變化。目前,功能基因的比較物理作圖進展較為迅速,1998年,李立家在玉米中對水稻、番茄、擬南芥的抗病基因Xa-21,Cf-9、Cf-2及RPS2進行了染色體定位,發(fā)現(xiàn)在玉米基因組中均存在著與上述基因高度同源的序列(李立家,1998,武漢大學博士論文);鄢慧民等利用BAC-FISH對水稻Xa-21基因在栽培稻和玉米中進行的比較物理定位發(fā)現(xiàn),在栽培稻第11染色體長臂檢出1個同源位點,而在玉米中則在第1、3和8染色體上檢測到3個同源位點,從而證明玉米基因組在進化中經(jīng)歷了序列加倍。與此同時,任南等以水稻DNA作為探針,對玉米進行基因組原位雜交還發(fā)現(xiàn),玉米10條染色體上廣泛存在與水稻DNA同源區(qū)段,玉米基因保守的或重要的部分與非保守部分的排列是相間的,而且保守或重要的基因是集中分布而不是分散的,推測這些集中分布的基因在功能上可能存在著某種相關性。在最近的研究中,我們利用與水稻抗病基因Pi-5(t)、Gm-2,Gm-6連鎖的BAC克隆在藥用野生稻中進行了染色體定位,供試的BAC克隆的雜交信號僅僅集中在藥用野生稻一個特定位點。這意味著BAC克隆中包含的單或低拷貝序列在栽培稻、藥用野生稻和玉米分歧的進化過程中仍舊連在一起,是同線的。此外,在對抗病基因Xa-5在栽培稻與藥用野生稻中BAC-FISH比較定位發(fā)現(xiàn),該基因同源順序分別位于栽培稻和藥用野生稻第5染色體短臂和長臂上,根據(jù)這種反映在染色體核型上的變化,我們推測在進化的過程中,在藥用野生稻可能發(fā)生了含著絲粒在內(nèi)的倒位,顯然,比較的BAC-FISH不只是單個標記的比較,它可以提供種間多個不同單或低拷貝序列的分布位置同線性和進化變異的信息。3生物基因組的全序列及基于序列的數(shù)據(jù)導向比較作圖的研究意義在于:一、根據(jù)不同種的基因組基因及其排列順序的高度保守特點繪制而成的比較圖,可以研究和探明它們的進化線索。廣泛的比較作圖可為多個種所用,建立它們之間的聯(lián)系框架或系統(tǒng)。如1995年,Moore等通過對來源于水稻12條染色體的19個片段在玉米、小麥、甘蔗、甜菜和高粱的相應連鎖群上的定位研究,最終構建出了禾本科原始祖先的染色體圖。這對于重要禾本科作物的遺傳育種具有重要的理論指導意義。二、解讀基因組序列,即通過同源性比較來推測未知基因的功能。目前,在基因組研究中,更系統(tǒng)化的研究方式莫過于獲取生物體全部基因序列。由于“人類基因組計劃”的實施,一些生物基因組全序列已被獲得,基因組學已成為生命科學乃至生物產(chǎn)業(yè)的先遣學科,基因組學一改傳統(tǒng)“模型導向”的研究模式,凸現(xiàn)其“數(shù)據(jù)導向”的特點。生物信息學(bioinformatics)在植物比較基因組研究中的引入就是很好的例子。如Pellegrini等