斑馬魚整體原位雜交技術(shù)研究進展

斑馬魚整體原位雜交技術(shù)研究進展

本生魚體積小，飼養(yǎng)成本低，易于獲得種子，通常是透明的。許多遺傳因素與高等動物的基因有一層關(guān)系，因此成為一種廣泛使用的模式動物。斑馬魚整體RNA原位雜交的結(jié)果可從整體水平直觀地反映目的基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中的時空表達情況和表達的發(fā)育圖式,并可用于分析目的基因在相應組織或器官形成中的作用。目前國內(nèi)已有利用斑馬魚整體原位雜交來研究功能基因的時空表達模式方面的報道,但對斑馬魚原位雜交方法建立的報道不多。本研究室在建立班馬魚胚胎整體原位雜交技術(shù)平臺的過程中,發(fā)現(xiàn)采用傳統(tǒng)方法獲得的雜交結(jié)果背景較高、特異性不強,且實驗操作較繁雜、成本高。因此本文在雜交探針制備、胚胎脫色、控制蛋白酶K消化、探針加入和洗脫及底物顯色等方面進行了優(yōu)化改良,成功建立了一套實用、簡單、特異性高、成本低廉的斑馬魚整體原位雜交的改良方法。1材料和方法1.1材料表面1.1.1斑馬魚的飼養(yǎng)、繁殖、培育和收集收集實驗用斑馬魚均為野生型AB品系。本實驗室根據(jù)WesterfieldM所描述的方法對斑馬魚進行飼養(yǎng)、繁殖、培育和收集受精卵。所獲胚胎培養(yǎng)于28.5℃隔水式培養(yǎng)箱中,按Kimme描述的形態(tài)特征確定胚胎發(fā)育階段。1.1.2處理和滅菌臺式冷凍離心機(Eppendorf)、恒溫水浴鍋、水平搖床。所有在雜交前和雜交中使用的器械、容器、移液管、槍頭等,均用1‰的DEPC水浸泡處理并高壓滅菌。使用過的器材經(jīng)高壓除菌后進行相應處理。1.1.3轉(zhuǎn)錄、測定和分析方法地高辛標記的核糖核苷酸混合物、耦連堿性磷酸酶的抗地高辛抗體購自瑞士Roche公司;T7、Sp6轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司;NBT/BCIP檢測試劑盒購自上海生工公司;小羊血清購自北京鼎國;酵母tRNA、BSA、肝素、左旋咪唑、PFA、甲酰胺、DEPC、蛋白酶K均購自美國Sigma公司。1.2斑馬魚胚胎的改良根據(jù)WesterfieldM描述的經(jīng)典原位雜交方法,結(jié)合本實驗室的儀器設(shè)備、試劑藥品及斑馬魚胚胎質(zhì)量的實際情況進行改良。主要步驟包括探針的制備、胚胎的固定、脫色、再固定、脫水、復水、蛋白酶K消化、再固定、預雜交、雜交、雜交終止、抗體孵育和底物顯色等。在室溫下對斑馬魚胚胎進行洗滌及抗體孵育的過程都需放置于水平搖床上進行。1.2.1rt-pcr法純化rnaNppa為斑馬魚心房利鈉肽基因,是斑馬魚心房發(fā)育成熟的標志基因。當胚胎發(fā)育到兩天時,Nppa在心房和心室均有表達;當胚胎發(fā)育到第三天時,Nppa僅局限于心房表達。因此本文選用Nppa基因來驗證胚胎原位雜交方法的改良效果。選擇Nppa基因(NCBI登陸號:NM＿198800)68nt～457nt之間的特異性片段,經(jīng)RT-PCR擴增后亞克隆到pGEM-T載體,測序證實插入了正向連接的目的片段。重組質(zhì)粒分別經(jīng)NcoⅠ、SpeⅠ酶切完全后,用酚/氯仿抽提法純化而獲得線性化轉(zhuǎn)錄模板,再分別以Sp6RNA聚合酶和T7聚合酶催化合成正義和反義RNA探針。體外合成RNA的轉(zhuǎn)錄體系:模板DNA1μg、地高辛標記物1μL、RNA酶抑制劑20U、DTT1μL、5×轉(zhuǎn)錄緩沖液2μL、T7或Sp6聚合酶20U,加ddH2O至10μL;轉(zhuǎn)錄條件:37℃水浴2h;轉(zhuǎn)錄結(jié)果:以紫外分光光度計測定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物濃度而確定。RNA探針經(jīng)乙醇沉淀后溶于50μL正雜交液(HYB+:50%甲酰胺、5×SSC、0.1%tween-20、5mg/mL酵母tRNA、50μg/mL肝素、檸檬酸調(diào)pH至6.0),存放于-20℃冰箱中。1.2.2撥除卵膜和脫色按計劃收集和分選不同發(fā)育時期的胚胎。固定:發(fā)育時間少于20h的胚胎,以4%PFA(新鮮配制)固定12h后用皮試針在體視鏡下?lián)艹涯?發(fā)育時間超過20h的胚胎,先撥除卵膜,再用4%PFA固定12h。脫色:用脫色液對胚胎避光脫色15min,4%PFA固定30min,再用PBST(含0.1%tween-20的PBS溶液)沖洗4次(每次5min)。脫水保存:固定后的胚胎依次通過25%、50%、75%甲醇/PBST溶液梯度脫水5min/次,再用甲醇置換2次后置-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.3斑馬魚胚胎的制備將保存于甲醇中的胚胎水化:依次通過75%、50%、25%甲醇/PBST和PBST溶液各漂洗5min/次,4%PFA固定30min,PBST漂洗固定后的胚胎4次(每次3min)。蛋白酶K消化:蛋白酶K(10μg/mL)在37℃水浴消化發(fā)育48h的斑馬魚胚胎(經(jīng)脫色液處理的)3min,PBST快速洗2次,以4%PFA重固定,PBST漂洗4次。預雜交:將胚胎在負雜交液(HYB-:50%甲酰胺、5×SSC、0.1%tween-20)中于60℃恒溫水浴15min,然后加入HYB+于60℃預雜交6h。雜交:將胚胎在加入探針(按1ng/μL、10ng/μL、50ng/μL的濃度梯度稀釋于HYB+)的HYB+中于60℃雜交16h～18h。1.2.4ssc的沖洗終止雜交:將探針雜交后的胚胎依次在預熱的HYB-、75%HYB-/25%2×SSC、50%HYB-/50%2×SSC、25%HYB-/75%2×SSC的混合液中于60℃分別漂洗10min;0.2×SSC溶液60℃漂洗2次(每次30min);室溫下依次在75%0.2×SSC/25%PBST、50%0.2×SSC/50%PBST、25%0.2×SSC/75%PBST、100%PBST溶液中分別漂洗15min。封閉:封閉液(2mg/mLBSA、5%綿羊血清的PBST溶液)室溫封閉3h～5h?？贵w孵育:抗地高辛抗體/封閉液以1:3000比例于4℃孵育胚胎過夜。1.2.5各體壓色顯色液用含2mg/mLBSA的PBST溶液漂洗胚胎8次(每次20min),再用顯色緩沖液(pH9.5的100mMTris、100mMNaCl、5mmol/L左旋咪唑、0.1%tween-20)室溫漂洗3次(每次5min)。隨后加入NBT/BCIP顯色液(250μg/mLNBT、187.5μg/mLBCIP)避光顯色,每隔10min～30min觀察顯色效果。當顯色良好時,用PBST漂洗胚胎4次(每次10min)以終止顯色,在體視鏡下拍照。也可將胚胎用甲醇/PBST溶液梯度脫水后保存于-20℃甲醇中。2結(jié)果2.1脫色:pbst法根據(jù)斑馬魚胚胎發(fā)育的不同階段,脫色處理不同。本研究發(fā)現(xiàn),發(fā)育時間超過24h的胚胎,用改進的脫色液進行脫色處理。常規(guī)脫色液(6%過氧化氫的PBST溶液)脫色時處理時間長,且脫色效果不理想,尤其難以消除胚胎眼部色素(圖1A);而用改進的脫色液(5%過氧化氫和5%氫氧化鉀的PBST溶液)漂白斑馬魚胚胎,僅需10min～15min即可將胚胎脫色透明(圖1B),且胚胎組織形態(tài)的完整性不受影響。2.2心肌缺血劑對胚胎組織的影響本實驗對發(fā)育48h脫色后的胚胎,用蛋白酶K在37℃水浴條件下進行消化,摸索調(diào)整的消化時間是3min,實驗結(jié)果表明:胚胎組織完整性良好,心臟特異性標記探針nppa的雜交信號高度特異性地顯示在胚胎的心臟(圖2A),染色清晰且背景低。作為對照,脫色胚胎采用傳統(tǒng)的消化時間(48h胚胎用蛋白酶K處理20min),則會導致胚胎損壞,組織彌散,染色背景高,雜交信號雜亂(圖2C);如果胚胎消化時間不足,使得探針不能有效地滲透至組織內(nèi),最終導致雜交信號微弱或零信號(圖2B)。2.3探針濃度的影響每次加入探針雜交前都需對探針做變性處理,以消除單鏈RNA自發(fā)形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。探針預處理的方法:把正雜交液稀釋的探針置于72℃水浴變性5min后迅速冰浴5min。另外,探針濃度的高低對于雜交信號的強弱、清晰度以及背景的高低都有很大的影響。本實驗將nppa反義探針按1ng/μL、10ng/μL、20ng/μL、50ng/μL的濃度梯度稀釋于HYB+中進行雜交,發(fā)現(xiàn)采用1ng/μL探針濃度,能得到著色清晰、雜交信號特異性強、低背景的淺藍色心臟組織結(jié)果(圖3A);探針濃度為10ng/μL和50ng/μL時,雜交信號非常強烈、背景高,影響了心臟特異性顯色(圖3B)。2.4胚胎前周內(nèi)特征結(jié)果為期內(nèi)外交回,胚胎心臟以心臟病理背景;用改良后的脫色、蛋白酶K消化、1ng/μL的反義探針濃度對發(fā)育48h野生型斑馬魚胚胎進行整體原位雜交,結(jié)果顯示胚胎頭部色素已完全去除,胚胎心臟(包括心房和心室)著色清晰、雜交信號特異性強、雜交背景低,利于觀察與分析(圖4A)。而傳統(tǒng)的整體原位雜交方法顯色的胚胎,心臟部位雖有顯色信號,但背景顯色深(胚胎的整個頭部都有深度顯色)且頭部色素沒有完全去除,無法清晰地分辯心臟特異性顯色(圖4D)。3高背景、低信號斑馬魚整體原位雜交中最易出現(xiàn)的問題是高背景、低信號。為避免這一現(xiàn)象,本研究在實驗過程中從探針、脫色、消化、漂洗、顯色等方面進行了優(yōu)化改良。3.1探針的合成和穩(wěn)定性原位雜交的結(jié)果是否具有較高的特異性和干凈的背景,很大程度上是由所選探針片斷的特異性和探針合成的質(zhì)量所決定的。探針要選擇特異性高、GC含量適中、跨越內(nèi)含子的一段cDNA序列。探針模板線性化要充分徹底,痕量的環(huán)化質(zhì)?？蓢乐赜绊戅D(zhuǎn)錄效率。另外,探針轉(zhuǎn)錄體系中加入的模板量需達到1ug才能保證高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄。3.2斑馬魚胚胎的消化蛋白酶處理的目的是為了提高胚胎組織對探針的通透性,以便探針能有效地進入組織細胞內(nèi)與靶分子進行雜交。本研究結(jié)合斑馬魚胚胎發(fā)育的情況,對未脫色的胚胎用蛋白酶K在37℃水浴條件下,進行消化時間的有效調(diào)整:5體節(jié)之前的胚胎不消化,6～17體節(jié)的胚胎消化1min,18～24體節(jié)的胚胎消化2min,24h胚胎消化10min,48h胚胎消化20min;對脫色后的胚胎消化處理是:24h的胚胎消化20s,48h的胚胎消化3min。3.3降低顯色溫度本研究對常規(guī)顯色緩沖液(pH9.0的Tris、氯化鈉、氯化鎂、左旋咪唑和tween-20)進行簡化改良,略去了氯化鎂,在一定程度上降低了顯色背景。另外,在顯色過程中顯色溫度高可加快顯色速度,但易造成高本底。將溫度控制在25℃左右顯色較理想。3.4改性探針的使用本研究在一定程度上簡化了實驗試劑和儀器的使用,節(jié)省了實驗經(jīng)費和實驗時間,例如:(1)探針轉(zhuǎn)錄體系僅使用1μL地高辛標記的核糖核苷酸混合物,其用量是傳統(tǒng)操作的一半;(2)在保證實驗質(zhì)量的前提下,用沉淀法代替RNA純化試劑盒純化探針,節(jié)約了實驗時