南京工業(yè)大學(xué)生命工程與技術(shù)概論限選課-基因工程

第六章基因工程及其應(yīng)用1基因工程的誕生三大理論基礎(chǔ)●遺傳物質(zhì)是DNA●DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)●密碼子的通用性●限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)●DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)●質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)三大技術(shù)基礎(chǔ)2高含油量的轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)基因蔬菜番茄醬基因工程的應(yīng)用31.1基因工程概念

基因工程：在生物體外，對生物體的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出所需要的基因產(chǎn)物。4基因工程過程示意圖②目的基因與載體DNA片斷的體外連接②④④篩選出含有重組子的細(xì)胞③將重組DNA分子引入細(xì)胞③①獲得目的基因①⑤外源基因的表達(dá),獲得所需要的產(chǎn)物獲得目的產(chǎn)物⑤5第一步：提取目的基因目的基因：編碼目的產(chǎn)物的基因取出DNA用限制酶切斷DNA例如：人胰島素基因人干擾素基因編碼某些酶的基因植物抗病基因等6◆印跡法方法◆逆轉(zhuǎn)錄合成法◆聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）7

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是在體外的小試管中通過酶促反應(yīng)有選擇地大量擴(kuò)增一段目的基因的技術(shù)。它把目的基因的尋找和擴(kuò)增，放在一個(gè)步驟里完成。PCR擴(kuò)增儀8聚合酶鏈反應(yīng)95℃目的基因37℃95℃55℃72℃72℃55℃/72℃95℃/55℃/72℃第一輪第二輪第三輪（1）變性（2）退火（3）延伸三個(gè)步驟9PCR動畫演示10將目的基因片斷從細(xì)胞內(nèi)提取需要基因的——限制性內(nèi)切酶。將目的基因與載體連接

需要基因的

——DNA連接酶。第二步：與載體的體外連接

11限制性內(nèi)切酶分布：從細(xì)菌中分離得到。特點(diǎn)：特異性，即識別特定核苷酸序列，切割特定切點(diǎn)。結(jié)果：產(chǎn)生黏性未端（堿基互補(bǔ)配對）。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切割點(diǎn)上將DNA分子切斷。目前已發(fā)現(xiàn)的限制酶有2000多種。12點(diǎn)擊播放舉例：大腸桿菌的一種限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。13DNA連接酶連接酶的作用：DNA連接酶是將堿基互補(bǔ)配對的兩個(gè)黏性末端連接起來，封閉DNA鏈上的缺口，使之成為一個(gè)完整的DNA分子。

連接的部位：可以催化DNA鏈上的5-PO4與3-OH生成磷酸二脂鍵。可用于將目的基因與載體的DNA連接起來。

14DNA連接酶的作用過程點(diǎn)擊播放15基因工程載體常用的載體：細(xì)菌或酵母菌的質(zhì)粒、λ噬菌體。載體是能將目的基因片段送入宿主細(xì)胞的工具?？膳c包含目的基因的外源DNA片段連接構(gòu)成重組體，并將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。

16質(zhì)粒：細(xì)菌細(xì)胞中自然存在于染色體外可以自主復(fù)制的一段環(huán)狀DNA分子。PUC118質(zhì)粒的基本結(jié)構(gòu)17★目的基因與載體連接，構(gòu)建了重組DNA分子18第三步：導(dǎo)入受體細(xì)胞并擴(kuò)增常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌、枯草桿菌、畢赤氏酵母和動植物細(xì)胞等。構(gòu)造好的重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，若受體細(xì)胞是細(xì)菌稱轉(zhuǎn)化，若受體細(xì)胞是動/植物細(xì)胞，通常稱為轉(zhuǎn)染。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增19第四步：篩選含有重組子的細(xì)胞重組DNA分子進(jìn)入寄主細(xì)胞后，其中的目的基因能否表達(dá)，表達(dá)效率高低，有很大差別。表達(dá)：指目的基因編碼的蛋白質(zhì)合成。檢測方法：1、特殊標(biāo)記(藍(lán)白斑、抗藥性)2、電泳檢測是否有所需的DNA片段或蛋白質(zhì)條帶201選擇目的基因及載體質(zhì)粒并酶切2混合連接3連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌4轉(zhuǎn)入平板培養(yǎng)5藍(lán)白菌菌落篩選6轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)獲得大量克隆基因?qū)⒛康幕蚩寺〉酱竽c桿菌中的步驟21DNA片斷的凝膠電泳蛋白質(zhì)PAGE電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白目的蛋白

細(xì)胞破碎液22第五步：獲得目的產(chǎn)物23第二節(jié)基因工程應(yīng)用（1）在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用

基因工程藥物人胰臟24胰島素1噸牛胰臟100克胰島素2000升發(fā)酵液100克胰島素干擾素1200升人血2－3萬美元/病人1升發(fā)酵液200－300美元/病人含有人胰島素的大腸桿菌400頭牛25（2）在環(huán)境工程中應(yīng)用

美國GE公司構(gòu)造成功具有巨大烴類分解能力的基因工程菌，并獲專利，用于清除石油污染。26（3）轉(zhuǎn)基因植物

1996-2005年，栽培率九千萬公頃，產(chǎn)值100億美元。27轉(zhuǎn)基因食品轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)