實(shí)驗(yàn)二血清蛋白電泳實(shí)驗(yàn)(范玉平)

血清蛋白電泳

(SerumProtein

Electrophoresis)血清和血漿血清:是指離體的血液經(jīng)過(guò)自然凝固而析出的液體部分.

血漿:是指離體并經(jīng)過(guò)抗凝的血液經(jīng)過(guò)離心沉淀后的上清部分.

血清中無(wú)纖維蛋白原簡(jiǎn)介人類(lèi)血液中有125種以上蛋白質(zhì)成分。白蛋白、脂蛋白、抗體、補(bǔ)體、凝血酶原和凝血因子、抗凝血因子、α1-抗胰蛋白、α1-糖蛋白、α2-巨球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和其他微量蛋白等成分。歷史1809年，Pehce(俄國(guó)物理學(xué)家)首先發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象1937年，Tiselius(瑞典)制成界面電泳儀，應(yīng)用于蛋白質(zhì)研究1948年，Wieland和Fischer建立了濾紙電泳法，奠定了區(qū)帶電泳技術(shù)的基礎(chǔ)1959年，Raymond和Weintraub創(chuàng)建聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳和電泳技術(shù)電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳技術(shù)指利用電泳現(xiàn)象對(duì)混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)。應(yīng)用電泳技術(shù)除了用于小分子物質(zhì)的分離分析外,最主要用于蛋白質(zhì),核酸等生物分子的研究.由于電泳法設(shè)備簡(jiǎn)單,操作方便,具有高分辨率及選擇性特點(diǎn),已成為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中常用的技術(shù).

COO-COO-COOH╱+H+╱+H+╱Pr←————→Pr←————→Pr╲+OH-╲+OH-╲NH2NH3+NH3+PH>PIPH=PIPH<PI電泳用于分離物質(zhì)的原理電泳分類(lèi)按分離的原理不同：區(qū)帶電泳、自由界面電泳、等速電泳、等電聚焦電泳按支持介質(zhì)的不同：紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳按支持介質(zhì)形狀不同：薄層電泳、板電泳和柱電泳按用途不同：分析電泳、制備電泳、定量免疫電泳和連續(xù)制備電泳。影響電泳的因素在電泳中,電場(chǎng),帶電粒子和促使帶電粒子移動(dòng)的介質(zhì)是產(chǎn)生電泳的三大要素.因而,影響電泳的主要因素有：電場(chǎng)強(qiáng)度的影響溶液的pH值溶液的離子強(qiáng)度電滲溫度、分子大小、吸附作用等電滲

液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)，由緩沖液的水分子和支持介質(zhì)的表面之間產(chǎn)生的一種相關(guān)電荷所引起。如果電滲與電泳方向相同，V變大；反之變小。血清蛋白醋酸

纖維素薄膜電泳原理在pH8.6堿性環(huán)境，血清蛋白均帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)各種蛋白質(zhì)pI不同，帶電荷量有差異蛋白質(zhì)的分子大小與分子形狀不相同帶電荷多、分子量小者，泳動(dòng)較快；反之則較慢蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量及遷移率蛋白質(zhì)名稱(chēng)等電點(diǎn)相對(duì)分子量電泳遷移率白蛋白4.846.9萬(wàn)5.9*10-5α1-球蛋白5.0620萬(wàn)5.1*10-5α2-球蛋白5.0630萬(wàn)4.1*10-5β-球蛋白5.129萬(wàn)～15萬(wàn)2.8*10-5γ-球蛋白6.86～7.3015.6萬(wàn)～30萬(wàn)1.0*10-5電泳結(jié)果示意圖γβα2α1清蛋白染色時(shí)染料與蛋白質(zhì)特異結(jié)合而不與醋纖膜結(jié)合，染色深淺與蛋白質(zhì)的量成正比染色一段時(shí)間后脫色，將各蛋白區(qū)帶剪下，經(jīng)脫色、比色即可計(jì)算出各蛋白質(zhì)組分的相對(duì)百分?jǐn)?shù)。如同時(shí)測(cè)定出總蛋白濃度，還可計(jì)算出各蛋白組分的絕對(duì)濃度正常血清電泳掃描圖譜試劑緩沖液：巴比妥緩沖液（pH8.6）染色液：麗春紅S染色液漂洗液：3%（V/V）醋酸溶液洗脫液：0.1mol/LNaOH溶液操作準(zhǔn)備電泳槽準(zhǔn)備CAM的準(zhǔn)備點(diǎn)樣吸3-5μl血清均勻點(diǎn)于CAM無(wú)光澤面電泳無(wú)光澤面朝下，點(diǎn)樣側(cè)置于負(fù)極端，通電染色將薄膜條浸入麗春紅S染色液，染5-10min漂洗

醋纖膜規(guī)格及點(diǎn)樣示意圖定量取試管6支，在白蛋白管內(nèi)加入0.1mol/LNaOH液6ml，其余各管加入3ml，將各蛋白區(qū)帶剪下分別置于各試管中，另從空白背景剪一塊平均大小的膜條置于空白管中，37℃10-20min向白蛋白管中加入40%醋酸0.6ml,其余各管加0.3ml,以中和部分NaOH用520nm比色，以空白管調(diào)零，讀各管吸光度計(jì)算設(shè)各部吸光度分別為AA、Aa1、Aa2、Aβ、Aγ。吸光度總和（AT）為：AT=AA+Aa1+Aa2+Aβ+Aγ

白蛋白（%）＝（AA*2

AT）*100%a1-球蛋白（%）=（Aa1AT）*100%

……注意事項(xiàng)通電時(shí)，不得接觸槽內(nèi)緩沖液或CAM，以防觸電緩沖液液面要保證一定高度標(biāo)本：血清應(yīng)新鮮，不得溶血染料：對(duì)蛋白質(zhì)的各組分親和力相同，水溶性好，穩(wěn)定，吸光度敏感，形成的染料蛋白質(zhì)復(fù)合物穩(wěn)定且易洗脫比色注意事項(xiàng)電泳后區(qū)帶拖尾、各區(qū)帶分開(kāi)不明顯原因：點(diǎn)樣過(guò)多點(diǎn)樣不均勻、不整齊樣品觸及薄膜邊緣；薄膜過(guò)濕，樣品擴(kuò)散；薄膜未完全浸透或溫度過(guò)高導(dǎo)致干燥或水分蒸發(fā)薄膜與濾紙橋接觸不良薄膜位置歪斜、彎曲，與電流方向不平行緩沖液變質(zhì)；樣品不新鮮CAM質(zhì)量不高等電滲現(xiàn)象

評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：CAM電泳具有靈敏度高，標(biāo)本用量少，分