基因工程-3章 基因工程載體

第三章基因工程載體

一、概述二、質(zhì)粒載體三、λ噬菌體載體四、酵母人工染色體載體2023/10/71一、概述(一)基因載體的概念基因載體:是指運載目的基因進入宿主細胞，使之能得到復制和進行表達的工具,化學本質(zhì)是DNA分子。按來源分:質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體、酵母人工染色體載體等。

按功能和用途分:克隆載體和表達載體，表達載體又分胞內(nèi)表達和分泌型表達載體。按性質(zhì)分：融合型載體、非融合型載體。按受體細胞:原核細胞載體和真核細胞載體。2023/10/72(二)基因載體的功能運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞。為外源基因提供復制能力或整合能力。為外源基因的擴增或表達提供必要的條件。2023/10/73(三)基因載體具備的特性①載體能在宿主細胞內(nèi)進行獨立和穩(wěn)定的DNA自我復制；或整合到染色體DNA上，隨著染色體DNA的復制而同步復制；在載體中插入外源基因后，仍然保持穩(wěn)定的復制狀態(tài)和遺傳特性。②載體易于從宿主細胞中分離，并進行純化。③載體都具有供外源基因插入的限制性內(nèi)切核酸酶位點，即多克隆位點。④載體都具有能夠觀察的表型特征(遺傳標記基因)，在插入外源基因后可作為重組DNA選擇的標志。2023/10/74⑤載體本身分子量比較小,可容納較大外源基因片段。⑥載體在細胞內(nèi)的拷貝數(shù)高，方便外源基因在細胞內(nèi)大量擴增。⑦載體在細胞內(nèi)穩(wěn)定性高，保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失。⑧載體都是安全的，不含對受體細胞有害的基因，并且不會任意轉(zhuǎn)入除受體細胞以外的其他生物細胞。2023/10/75(四)報告基因(或稱標記基因)報告基因：基因載體上引入的一些可證明載體已經(jīng)進入宿主細胞并可將含有目的基因的宿主細胞從其他細胞中識別區(qū)分甚至挑選出來的具有特殊標志意義的基因。常用的報告基因：抗藥性基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)、熒光酶基因(lux)、GFP等。2023/10/76(五)基因載體的致死效應(yīng)利用基因載體進行基因克隆時，有時大量的克隆基因及其基因表達產(chǎn)物對宿主細胞是有害的，不利于宿主細胞的生長繁殖，甚至可使宿主細胞中毒死亡的現(xiàn)象?？朔蜉d體致死效應(yīng)的對策：⑴使用嚴密型質(zhì)粒來分離、純化多拷貝的松弛型質(zhì)粒上大量表達時,可呈現(xiàn)致死效應(yīng)的功能性基因,即用松弛型質(zhì)粒與嚴密型質(zhì)粒雜交改良。⑵使用溫度敏感型載體。在較低溫度下，目的基因不表達,宿主菌可自由生長；當宿主菌增殖達到一定數(shù)量后,提高培養(yǎng)溫度,使目的基因大量表達。2023/10/77二、質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體是以質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的基因載體，主要用于原核生物和真核生物的基因轉(zhuǎn)移及建立基因組文庫和cDNA文庫。2023/10/78克隆載體(cloningvector)：是指用于擴增或保存外源DNA片段而設(shè)計的載體?？寺≥d體的結(jié)構(gòu)特征2023/10/79多克隆位點(multiplecloningsite)ori復制起始點遺傳標記pUCMCSAmpr2023/10/7101.質(zhì)粒(plasmid)的概念：

獨立于染色體外能夠進行自我復制的雙鏈DNA分子。質(zhì)粒分子成份：DNA、RNA。質(zhì)粒DNA的構(gòu)型：共價閉合環(huán)狀(ccc-DNA)、開環(huán)(oc-DNA)和線性(l-DNA)構(gòu)型。

Plasmidchromosome

ccc2.質(zhì)粒的生物學特性(1)質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài),但在一定地條件下又會可逆地整合到寄主染色體上,隨著染色體地復制而復制。(2)質(zhì)粒DNA在添加真核復制信號和啟動子后,可以構(gòu)建出能在原核和真核細胞中均可復制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細胞中表達，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。2023/10/7112023/10/712(3)質(zhì)粒的拷貝數(shù):

是指每個宿主細胞內(nèi)質(zhì)粒的數(shù)量。根據(jù)每個宿主細胞中質(zhì)粒拷貝數(shù)的多少,把質(zhì)粒分為嚴密型質(zhì)粒(拷貝數(shù)少,為1-5個)與松弛型質(zhì)粒(拷貝數(shù)多,可達10-200個拷貝)；松弛型質(zhì)粒DNA的復制不受宿主菌蛋白合成的影響，即當宿主菌蛋白合成受到抑制，而質(zhì)粒DNA復制可繼續(xù)進行，由數(shù)十個增至數(shù)千個。因此,通常選用松弛型質(zhì)粒作為基因載體。(4)質(zhì)粒的不相容性(incompatibility,又稱質(zhì)粒的不親和性)：在沒有選擇壓力的調(diào)節(jié)下，兩種不同質(zhì)粒不能共存同一宿主細胞內(nèi)的現(xiàn)象。3.質(zhì)粒載體的發(fā)展概況第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二階段：增大載體容量(降低載體長度)，建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標記基因,如pUC系列載體。第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。2023/10/7134.質(zhì)粒的標記基因(又稱報告基因)標記基因按其用途分為2類：選擇標記基因:用于鑒別目的載體的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來。篩選標記基因:用于區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，可將攜帶了外源DNA片段的重組質(zhì)粒挑選出來。2023/10/7142023/10/7154.1選擇標記基因4.2篩選標記基因

(1)插入失活(insertionalinactivation)

在質(zhì)粒pBR322的抗四環(huán)素基因上插入一個外源基因后，導致抗四環(huán)素基因失活，變成只對氨芐青霉素有抗性，這樣就可通過對抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源基因片段插入到載體中，這種篩選方法稱為插入失活。

2023/10/7162023/10/717抗藥性標記選擇(插入失活法)

(2)α-互補(α-complementation)是指β-半乳糖苷酶基因(LacZ)上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的LacZ基因的突變體之間實現(xiàn)互補，從而產(chǎn)生具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白，這種現(xiàn)象就稱為α-互補。2023/10/7182023/10/7195.質(zhì)粒載體的多克隆位點基因工程載體含有一個人工合成的多種限制性內(nèi)切核酸酶的單一識別序列，稱為多克隆位點(multiplecloningsite,MCS)。2023/10/7206.質(zhì)粒DNA的分離和純化方法眾多，主要依據(jù)：

1.分子大小不同

2.堿基組成不同

3.超螺旋共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)不同常用方法：堿變性抽提法、煮沸法、去污劑(如Triton或SDS)裂解法、羧基磷灰石柱層析法、質(zhì)粒DNA釋放法等。2023/10/721⑴堿變性抽提法原理利用染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復性存在著差異達到分離的目的。在pH達12.6的堿性條件下，染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性；質(zhì)粒DNA的大多數(shù)氫鍵斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補鏈不能完全分離；用pH4.8的NaAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復到原來的構(gòu)型，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復合物等一起沉淀除去，質(zhì)粒DNA則留在溶液中，因而提取到質(zhì)粒DNA。2023/10/7222023/10/723⑵大腸桿菌質(zhì)粒DNA的分離提取(離心收集細胞)苯酚--氯仿抽提氯化銫梯度+溴化乙錠離心+去污劑/NaOH細胞懸浮+溶菌酶KAc調(diào)節(jié)pH中性變性蛋白水相(質(zhì)粒+RNA）質(zhì)粒超螺旋取出水相：1.乙醇沉淀2.RNA酶1.收集質(zhì)粒超螺旋2.乙醇沉淀純凈的質(zhì)粒大腸桿菌培養(yǎng)液2023/10/724pET28c(+)電泳結(jié)果⑶堿抽提法所用試劑的生化作用

所用的試劑：溶菌酶、LB培養(yǎng)基、葡萄糖/Tris/EDTA溶液(5Ommol/L葡萄糖；25mmol/LTris﹒HCl；pH8.0，lOmmol/LEDTA)、TE緩沖液、NaOH-SDS溶液、3mol/L醋酸鉀溶液、異丙醇、100%乙醇和70%乙醇等。2023/10/725①溶菌酶:

糖苷水解酶，水解菌體細胞壁的主要化學鍵——肽聚糖β-1,4糖苷鍵?！嗑哂腥芫饔谩Ｆ咸烟?

增加溶液粘度，維持滲透壓，防止機械剪切力對DNA的降解。

EDTA(乙二胺四乙酸):

螯合Mg2+和Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶活性(抑制DNA降解),有利于溶菌作用和DNA完整釋放。

2023/10/726②NaOH-SDS液:

NaOH濃度為0.2mol/L，加入抽提液時，該系統(tǒng)的pH高達12.6，引起染色體DNA和質(zhì)粒DNA變性。SDS(十二烷基磺酸鈉)——離子型表面活性劑，可溶解細胞膜脂質(zhì)與蛋白，破壞細胞膜；解聚核蛋白，能與蛋白質(zhì)結(jié)合成R-O-S03-…R+一蛋白質(zhì)復合物,使蛋白質(zhì)變性沉淀下來。2023/10/727③KAc:pH4.8KAc溶液可將pHl2.6的抽提液調(diào)節(jié)至中性→使變性質(zhì)粒DNA復性，并穩(wěn)定存在于溶液中。3mol/L高鹽KAc→染色體DNA變性、RNA、SDS-蛋白復合物凝聚沉淀。因為染色體DNA核酸上電荷被中和，減少斥力而互相聚合，鉀鹽與RNA、SDS-蛋白復合物作用，形成鉀鹽復合物，使沉淀更完全。

2023/10/728④無水乙醇:

沉淀DNA

優(yōu)點：具有很強的吸水性，可以任意比例和水相混溶，且乙醇與核酸不起任何反應(yīng)，對DNA很安全。

DNA溶液(DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在)，當加入乙醇時，乙醇將奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而聚合。2023/10/729⑤苯酚-氯仿溶液:苯酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當?shù)鞍踪|(zhì)水溶液與苯酚或氯仿混合時，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被苯酚或氯仿擠出，使蛋白質(zhì)失水而變性。密度：苯酚-氯仿＞變性蛋白質(zhì)＞水相離心：從上到下：

上層：水相；

中間：變性蛋白質(zhì)；

下層：苯酚-氯仿

使變性蛋白質(zhì)與水相中的DNA分開！2023/10/730⑥異戊醇:

降低分子表面張力，減少抽提過程中泡沫的產(chǎn)生。此外，有助于相的穩(wěn)定。使離心后的上層水相、中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。2023/10/7317.常用質(zhì)粒載體2023/10/7322023/10/733⑴pBR322質(zhì)粒載體pBR322質(zhì)粒載體的組成含pSF2124質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子Tn3的氨芐青霉素抗性基因(ampr)含有pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因(tetr)ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復制起點。2023/10/734pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點pBR322分子量較小,長度為4363bp的環(huán)狀雙鏈DNA。pBR322具有2種抗菌素抗性基因,抗四環(huán)素基因(tetr)和抗氨芐青霉素基因(ampr),可供作為選擇標志。pBR322具有較高的拷貝數(shù),15-20個/細胞，為重組體DNA制備提供了極大方便。含有5個單一的限制性內(nèi)切核酸酶位點。pBR322DNA被限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的片段大小已知道，可作為核酸電泳的分子質(zhì)量標準。2023/10/7352023/10/736pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板⑵pUC質(zhì)粒載體pUC質(zhì)粒在pBR322基礎(chǔ)上改建的，其組成如下：含有pBR322質(zhì)粒的復制起點(ori)。含有氨芐青霉素抗性基因(ampr)基因。含有大腸桿菌

-半乳糖酶基因(lacZ)的啟動子及其編碼

-肽鏈的DNA序列(即lacZ′基因)。位于lacZ′基因中靠近5’端引入了一段有多克隆位點(MCS)區(qū)段,但它不會引起編碼肽鏈功能的改變。2023/10/7372023/10/7382023/10/739pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點：具有較小的相對分子質(zhì)量和更高的拷貝數(shù)，可達500-700個拷貝/細胞。適用于組織化學方法檢測重組體,有來自大腸桿菌lac操