微生物實驗-PCR技術在細菌鑒定中的應用

聚合酶鏈式反應PCRPolymeraseChainReaction實驗四PCR技術在細菌鑒定中的應用病原生物學與免疫學教研室1.熟悉PCR試驗的原理、方法和實際應用及注意事項。2.熟悉瓊脂糖凝膠電泳的原理、實驗步驟及應用。目的要求：本質：是體外以2n-1方式快速擴增DNA的方法變性：通過加熱使模板DNA完全變性成為單鏈，同時使引物自身和引物之間的發(fā)莢結構或局部雙鏈消除；退火：將溫度下降至適宜溫度，使引物與模板DNA退火結合；延伸：將溫度升高，熱穩(wěn)定DNA聚合酶以dNTP為底物催化新生DNA鏈延伸。PCR的基本反應包括三個步驟模板DNA模板DNA是待擴增序列的核酸?；蚪MDNA、質粒DNA、噬菌體DNA、cDNA等都能作為PCR反應的模板。特異性引物

引物是與靶DNA的3`端和5`端特異性結合的寡核苷酸片段。只有當每條引物都能特異性地與模板DNA中的靶序列形成穩(wěn)定的結構，才能保證其特異性。PCR的基本成分熱穩(wěn)定DNA聚合酶延伸引物從而達到特異DNA片段指數(shù)增長的效果。保真度高、可擴增幾個kb是現(xiàn)在熱穩(wěn)定DNA聚合酶發(fā)展的趨勢。dNTP

即dATP、dTTP、dGTP、dCTP。為引物延伸提供相應的材料。二價陽離子

用Mg2+或Mn2+。游離的二價陽離子配合熱穩(wěn)定DNA聚合酶使引物能夠發(fā)生延伸反應。PCR的基本成分緩沖液維持PCR反應體系的pH。常用Tris-HCl。一價陽離子

50mmol/L的KCl有利于擴增大于500bp長度的DNA片段；70-100mmol/L有利于擴增較短的DNA片段（小于500bp）。PCR的基本成分PCR加樣程序加樣完畢后，離心或手指輕彈使溶液完全混勻。編號樣品用量（μL）備注（1）雙蒸水6μL

（2）引物2μL上、下游引物已混合（3）2×TaqPCRMasterMixdNTP10μL

用3號管直接加其它各樣bufferTaqPolymeraseTris-HCLKClMgCl2(4)模板DNA2μL

合計20μL

94℃

4min(預熱，激活DNA聚合酶）｛72℃5min(完全延伸）4℃暫時保存94℃30sec(熱變性）58℃30sec(退火）72℃25sec(延伸）30個循環(huán)擴增總時間為1小時17分鐘，電泳時間約為30分鐘。PCR反應參數(shù)擴增的序列大腸桿菌的擴增長度：323bpggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacggaagttttcagagatgagaatgtgccttcgggaaccgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggtt大腸桿菌引物序列：5＇to3＇F：GGAGCAAACAGGATTAGATACCCR：AACCCAACATTTCACAACACGPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖可充當液相介質，對雙鏈DNA的分離起到分子篩作用，瓊脂糖濃度決定了分子篩的大小。在正負電壓下，DNA在其中呈“Z”型泳動。在穩(wěn)壓情況下，DNA片段越大，泳動的越慢，DNA片段越小，泳動的越快，從而達到分離DNA的功能。PCR產(chǎn)物電泳原理DNA經(jīng)PCR擴增后，與溴化乙啶（EB）或替代品嵌合后，與上樣液（loadingbuffer)混合（其混合液密度大于電泳液的密度），加于預先做好的瓊脂糖（1%）凹形孔中，在電場力的作用下，帶負電的DNA在瓊脂糖中進行泳動，從而達到分離DNA的目的。EBGillgreenGoldviewDNAMarker的作用DNA

Marker：為比對待檢樣DNA大小的標尺。PCR產(chǎn)物PCR產(chǎn)物1.10uLPCR產(chǎn)物與2uL

LoadingBuffer（6×）混和；2.用加樣強將混合物點樣；3.電泳，100V，30min。4.紫外成像觀察。操作步驟

PCR在臨床上主要用于病原體的檢測，包括患者是否受到某種病