免疫親和純化和免疫沉淀

免疫親和純化和免疫沉淀技術(shù)瀘州醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室劉佳佳20010年4月親和層析及沉淀的用途親和層析及沉淀被認(rèn)為是分離純化酶及蛋白質(zhì)的強有力的技術(shù)手段，這種方法可以較經(jīng)濟(jì)有效地使用配基，能夠大規(guī)模、快速、特異性地分離、純化酶及蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)（酶）存在于一切生物體中，是非常重要的生物大分子。蛋白質(zhì)是生物功能的執(zhí)行者，擔(dān)負(fù)著生物催化、物質(zhì)運輸、運動、防御、調(diào)控及記憶、識別等多種生理功能。蛋白質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)分離純化是用生物工程下游技術(shù)從混合物之中分離純化出所需要得到的目的蛋白質(zhì)的方法。蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)是當(dāng)代生物產(chǎn)業(yè)和生命科學(xué)研究當(dāng)中的核心技術(shù)。該技術(shù)難度和成本均高；例如一個生物藥品的成本75%都花在下游蛋白質(zhì)分離純化當(dāng)中。

生物工程上游技術(shù):是理論的研究,技術(shù)的開發(fā)等,如：基因工程、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能研究等。生物工程下游技術(shù)：一般包括產(chǎn)物（一般為蛋白質(zhì)）的預(yù)處理及分離純化；產(chǎn)品的成型加工和質(zhì)量監(jiān)控等一系列單元操作和過程中的主要技術(shù),其中生化產(chǎn)物及發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化是其核心內(nèi)容。下游技術(shù)是生物工程重要組成部分,是生物高科技技術(shù)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵，如：酶工程,發(fā)酵工程等（提取干擾素、胰島素和酶等）。

蛋白質(zhì)分離純化的意義①從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對于了解生命活動的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。②工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。③醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。④基因工程的需要：DNA合成酶、RNA逆轉(zhuǎn)錄酶等。蛋白純化策略

分離蛋白質(zhì)常用的純化方法有超速離心和梯度密度離心法、鹽析法、電泳、凝膠過濾（分子篩）、離子交換層析、親和層析以及高效液相色譜等方法……。親和沉析技術(shù)是純化各種生物大分子最有效的方法之一。

超速離心

是分離亞細(xì)胞及蛋白質(zhì)大分子的有效手段，往往是進(jìn)一步純化的第一次過篩。超速離心又分差速離心和梯度離心。用超速離心或梯度離心分離和純化抗原只是一種根據(jù)蛋白的比重特點分離的方法，除個別成分外，極難將某一抗原成分分離出來。目前僅用于少部分大分子抗原，如IgM、C1q、甲狀腺球蛋白等，以及一些比重較輕的抗原蛋白如載脂蛋白A、B等。對于大量的中、小分子量蛋白質(zhì)，多不適宜用超速及梯度密度離心作為純化手段。

鹽析沉淀法

是最古老而又經(jīng)典的蛋白質(zhì)純化分離技術(shù)。由于方法簡便、有效、不損害蛋白抗原活性等優(yōu)點，至今仍被廣泛應(yīng)用。

鹽析法原理鹽析沉淀法的原理

因為蛋白質(zhì)是親水性大分子，所以在水溶液中有雙電層結(jié)構(gòu)的水合膜，來保證分子的溶解度平衡并穩(wěn)定存在。當(dāng)加入鹽時，鹽會電離成離子態(tài)，離子的電性破壞了蛋白質(zhì)的雙電層的水合膜結(jié)構(gòu)，從而使其沉降，析出。

加入濃酸和濃堿是不行的，苛性的環(huán)境將使蛋白質(zhì)變性。

凝膠過濾和離子交換層析

凝膠過濾又稱凝膠柱層析、分子篩層析，利用微孔凝膠，將不同分子量的成分分離。離子交換層析是利用一些帶離子基團(tuán)的纖維素或凝膠，吸附帶相反電荷的蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)按帶電荷不同或量的差異分成不同的組分。這兩種層析如能共同應(yīng)用或者反復(fù)應(yīng)用其中的一種，皆可將某一蛋白質(zhì)從一復(fù)雜的組分中純化出來。

凝膠過濾(分子篩層析)圖示1凝膠過濾(分子篩層析)圖示2

離子交換層析柱

親和層析

是利用生物大分子的生物學(xué)特異性，即生物分子間所具有的專一性親和力而設(shè)計的層析技術(shù)。例如抗原和抗體（免疫親和層析）、酶和酶抑制劑（或配體）、酶蛋白和輔酶、激素和受體等之間有一種特殊的親和力，在一定條件下，它們能緊密地結(jié)合成復(fù)合物。如果將復(fù)合物的一方固定在不溶性載體或共價結(jié)合在一種惰性的微珠上，則可從溶液中專一地分離和提純另一方。與上述其他純化方法相比，親和層析能產(chǎn)生相當(dāng)高的純化作用。另外，此法的優(yōu)點是迅速，有時僅一步即可達(dá)到純化的目的。

免疫親和純化技術(shù)

親和純化(affinitypurification)是基于目標(biāo)分子與固定化配體的特異性相互作用(如：抗原-抗體)。親和技術(shù)可用來從混和物中分離特定分子。捕獲目標(biāo)分子用于相互作用研究,或從反應(yīng)體系中去除某一成分。免疫親和純化原理免疫親和純化是一種分離各種生物大分子最有效的方法特點：

1、高純化率，通常為常規(guī)純化的1,000-10,000倍以上。2、由于內(nèi)在的背景限制，如目標(biāo)抗原量非常稀少，需與其他方法結(jié)合才能獲得均質(zhì)性產(chǎn)物。3、快速純化抗原，層析柱?？芍貜?fù)使用?？砂凑詹煌?guī)模進(jìn)行，半天內(nèi)即可完成。4、不僅適用于純化抗原，也可用來分離經(jīng)過初步純化的抗體，乃至所有能與相應(yīng)配體有效結(jié)合的生物分子。5、抗體與其相應(yīng)抗原結(jié)合具有高度親和力和特異性，能大量分離天然狀態(tài)或近似天然狀態(tài)的抗原。6、需要適當(dāng)純化的抗體，不是所有的抗體都適用于免疫親和層析，但一旦獲得一種性能良好的抗體，純化過程就簡單、快速、可靠。7、不能用于定量測定。

免疫親和純化技術(shù)發(fā)展歷史：最早是將抗體作為一種結(jié)合劑用于免疫親和純化，根據(jù)其自身交聯(lián)產(chǎn)生大量多聚體和不溶性基質(zhì)原理收集抗原。隨后利用抗體與惰性微珠共價結(jié)合，雖然這是一種簡單的結(jié)合，但抗體的許多反應(yīng)性因缺乏定位作用或抗體的過量結(jié)合而喪失。通過研究發(fā)現(xiàn)，抗體與蛋白A和蛋白G微珠共價連接后更容易與抗原結(jié)合。將具有良好抗原結(jié)合特性且來源廣泛的各種單克隆抗體制成免疫親和層析柱，已成為一種最適用和有效的純化方法。親和層析技術(shù)最先是由Cuatrecasas等人建立（1968年）。

BCX2003P2.PPT影響免疫親和層析純化效果的因素

抗原初始相對濃度（即純度）：是決定最終產(chǎn)物純度極為重要的因素?？乖c抗體的親和力：是免疫親和純化層析過程中最麻煩的問題。高親和力抗體（>10-8mol/L)能在1h以內(nèi)達(dá)到有效的分離，而低親和力的抗體(﹤10-6mol/L）即使在高濃度時也不能結(jié)合溶液中的全部抗原。使用針對同一抗原多個表位的多克隆抗體以增強親和力的方法固然可結(jié)合較多的抗原，但增加了洗脫的困難性。只有當(dāng)所需的最終產(chǎn)物為變性蛋白時，才選用識別多個表位的抗體。免疫親和純化的關(guān)鍵：高親和力與容易洗脫的優(yōu)化組合。常見錯誤是將低親和力和容易洗脫等同看待。1．親和層析支持物的選擇:作為親和層析支持物須符合以下要求：①非特異性吸附低；②液體通過時流速要快；③在各種pH和高濃度鹽溶液中穩(wěn)定；④必須有合適的、豐富的化學(xué)基團(tuán)，能有效地與蛋白質(zhì)或其它化合物結(jié)合；⑤必須帶有豐富的微孔，以增加結(jié)合容量。符合以上5個條件的支持物有瓊脂糖、聚丙烯酰胺和多孔玻璃球，其中常用的是瓊脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B）。

2．配體的選擇:所謂配體系指具有親和性的雙方，作為免疫親和層析專指抗原與抗體。良好的配體必須具備以下3個條件。（1）抗原或抗體必須單一特異性：抗原或抗體的純化效果決定于固相中配體的純度。（2）抗原與抗體之間必須有強的親和力：這種親和力決定于抗原決定簇的性質(zhì)和數(shù)量。對抗體來說還決定于抗體來源動物的種類和免疫時間，如馬抗血清親和力較低，免疫血清親和力較高；免疫時間短的親和力低。但是，親和力太強也不利，因為解離抗原抗體復(fù)合物所需要的條件就要強烈，從而可造成蛋白質(zhì)的變性。例如用低pH（1.5～2.5）或高鹽（如6mol/L鹽酸胍）可使部分抗原或抗體活性降低或喪失。（3）配體必須有一個適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)：這個基團(tuán)不參與配體和大分子的特異結(jié)合，但可用來連接支持物，而且這種連接不應(yīng)當(dāng)影響配體與大分子結(jié)合的親和性。

3．抗原或抗體與支持物的結(jié)合將抗原或抗體結(jié)合到支持物上的方法目前有20多種，但可歸結(jié)為載體結(jié)合法、物理吸附法、交聯(lián)法和網(wǎng)絡(luò)法4類。

結(jié)合法的一般步驟是先活化支持物上的功能基團(tuán)，然后將抗原或抗體連接到這些活化的基團(tuán)上。用來發(fā)生交聯(lián)的化學(xué)反應(yīng)必須足夠溫和，不致使抗原或抗體遭到破壞。交聯(lián)后，要徹底清洗支持物，以除去剩下的未交聯(lián)的物質(zhì)。

最常用的支持物是Separose4B，將此支持物與溴化氰在pH11時進(jìn)行處理，則能使支持物活化。此時溴化氰與支持物上的羥式反應(yīng)形成氨基甲酸酯基團(tuán)。加入溴化氰的量取決于支持物的量。如果希望取代程度提高，則加入溴化氰的量也要提高。交聯(lián)時首先要注意加入抗原或抗體的濃度。通常在交聯(lián)反應(yīng)混合物中的交聯(lián)蛋白質(zhì)濃度應(yīng)是親和分離濃度的20～30倍。這樣，溴化氰濃度也必須提高到200mg/ml凝膠。若希望最終產(chǎn)物含量較少，所加入的溴化氰也應(yīng)減少。交聯(lián)時的pH也應(yīng)注意，pH9.5～10時，活化的瓊脂糖珠很不穩(wěn)定。降低pH，也就減少了能反應(yīng)的配體濃度，交聯(lián)量就會減少。

親和層析中常用小分子抗原或其它化合物與支持物交聯(lián)，由于載體空間的位阻而影響了與抗原或其它親和物的結(jié)合，產(chǎn)生了所謂的無效吸附。另外，Sepharose4B交聯(lián)時要求有一游離的氨基，如果該抗原有具氨基則難于交聯(lián)?；谶@兩個原因，通常在瓊脂糖與抗原之間接上不同長度的“手臂”。必要時這些“手臂”末端可接上游離氨基，以與不帶氨基的配基偶聯(lián)。常用的帶“手臂”瓊脂糖有氨基瓊脂糖（二亞胺）、羧基瓊脂糖（琥珀酸酐）、溴乙酰瓊脂糖（0-溴乙酰-N－羧基琥珀酰胺）、重氮鹽衍生物瓊脂糖和疏基瓊脂糖等。這些帶“手臂”的瓊脂糖有商品供應(yīng)，使用極為方便。

親和純化的多克隆抗體單克隆抗體信號強度(抗體結(jié)合容量）非常好視抗體而異，但應(yīng)該非常好特異性非常好非常好優(yōu)點洗脫峰形易分辨（已知），應(yīng)用不受限制，特異性強

特異性強缺點制備困難，應(yīng)用受限需要篩選合適的抗體

注：不推薦將未經(jīng)純化的多克隆抗體或混合的單克隆抗體用于免疫親和純化。

免疫親和純化層析的基本操作步驟：交聯(lián)→結(jié)合→洗脫1、將抗體與基質(zhì)（微珠）共價交聯(lián)并制備抗體親和層析柱。2、將抗原結(jié)合到抗體-基質(zhì)微珠上。3、抗原的洗脫。親和層析條件的選擇：

（1）支持物與抗原或抗體結(jié)合后，還可能有多余的活性基團(tuán)，為了封閉這些殘基團(tuán)，必須用無關(guān)蛋白質(zhì)或三乙醇胺過一次柱，以封閉活性基團(tuán)。（2）去掉未結(jié)合及結(jié)合不牢固的蛋白質(zhì)。先用0.2mol/LNaHCO2（含0.1mol/LNaC1，pH9.0）洗脫2～3個柱體積，再用解脫劑處理一次親和層析柱。（3）解脫劑有多種：常用的有0.2mol/LpH2.8甘氨酸－HC1緩沖液、0.1mol/LpH2.4甘氨酸緩沖液、7mol/L脲、5mol/LNaI、3mol/L硫氰酸鉀（或鈉）、1mol/L乙酸、6mol/L鹽酸胍、0.2mol/LKC1等。作為抗原抗體解脫劑，最多用的是3mol/L硫氰酸鉀（或鈉）及0.1mol/LpH2.4甘氨酸緩沖液?？贵w親和層析柱的制備：抗體與固相基質(zhì)的連接：1、最常用的基質(zhì)為蛋白A和蛋白G微珠，可與抗體的Fc功能區(qū)特異結(jié)合。2、將抗體直接與一種活性微珠（表達(dá)活性的反應(yīng)基團(tuán)）連接。

抗體與微珠的結(jié)合方法試劑優(yōu)點缺點與抗體結(jié)合的基團(tuán)蛋白A抗體定向確切，粒柱還能與其他無關(guān)二甲基庚二酸酯-NH2

容易結(jié)合的抗體結(jié)合，昂貴蛋白G抗體定向確切，粒柱還能與其他無關(guān)二甲基庚二酸酯-NH2

容易結(jié)合的抗體結(jié)合，昂貴活性微珠價廉，不結(jié)合抗體無定向性，且常羰基二咪唑-NH2

其他無關(guān)抗體因過量結(jié)合而損傷溴化氰-NH2