牙頸部流水線與牙周致病菌引起牙周炎的比較研究

牙頸部流水線與牙周致病菌引起牙周炎的比較研究

高糖飲食和緊密連接動物牙齒頸部是一種相對成熟、廣泛使用的方法。移植牙周阻力也是一種常見的方法。單獨使用其中的某一種方法,存在著建立牙周炎動物模型所需實驗時間長、可控性差的缺點,而多個誘導因素的聯(lián)用可較快地誘導牙周炎的形成。本研究的目的在于對高糖飼料加牙頸部絲線結(jié)扎與高糖飼料加牙頸部絲線結(jié)扎加接種牙周致病菌建立大鼠牙周炎模型的方法進行比較,觀察幾種方法在同一種動物引起牙周炎的病程是否相同,及尋找各種方法建立大鼠牙周炎模型的最佳時期。1.細菌培養(yǎng)和微生物測量1.1實驗動物及分組選用40只牙體牙列完整,無齲壞及牙周病的5周齡SD大鼠(四川大學華西校區(qū)實驗動物中心提供)。將40只大鼠隨機分為對照組(N組)和P1、P2及P3三個實驗組,每組10只大鼠。1.2實驗方法對N組大鼠不采取任何干預措施,常規(guī)喂飼鼠食和飲水。P1、P2、P3組大鼠均在肌肉注射200mg/kg的鹽酸氯胺酮麻醉后,用絲線結(jié)扎雙側(cè)上頜第二磨牙牙頸部,結(jié)扎線盡量放入齦溝內(nèi),遇結(jié)扎線脫落重新結(jié)扎。結(jié)扎后給予10%的糖水代替飲水。P2、P3組大鼠,在絲線結(jié)扎上頜第二磨牙牙頸部后,按每只大鼠每天20mg的劑量,將氨芐青霉素磨碎后放入飲水中口服,共3d,以便抑制不利于牙齦卟啉菌定居生長的內(nèi)源性細菌。喂飼氨芐青霉素3d后,通過管飼給予每只大鼠0.5ml1.5×109CFU/ml的牙齦卟啉單胞菌[Porphyromanusgingivalis(P.g),ATCC33277,由華西口腔微生物醫(yī)學工程重點實驗室提供]48h培養(yǎng)物(P2組)或0.5ml1.5×109CFU/ml的P.gATCC3327748h培養(yǎng)物+0.5ml1.5×109CFU/ml的具核梭桿菌[Fusobacteriumnucleatum(F.n),ATCC25586,由華西口腔微生物醫(yī)學工程重點實驗室提供]48h培養(yǎng)物(P3組)。以后每48h追加一次,共管飼細菌3次。以上動物在實驗前和喂飼細菌后第2、4周時對實驗牙進行微生物學檢查。1.3微生物學檢查分別在實驗前和喂飼細菌的第2、4周時每組隨機選取5只大鼠,去除結(jié)扎的絲線,用滅菌鑷子將滅菌紙尖插入牙周袋底,采集左上頜第二磨牙齦下菌斑,放置約10s后取出,將紙尖插入有1mlTD轉(zhuǎn)送液的厭氧轉(zhuǎn)送管管底送檢;將轉(zhuǎn)送管置于漩渦震蕩器上,震蕩1min,使菌斑團塊分散;取0.01ml樣本接種于牛心腦浸液-輔助瓊脂(BHI-S瓊脂)培養(yǎng)基,用三角推棒涂布均勻。厭氧培養(yǎng)48h。對初代培養(yǎng)物進行菌落計數(shù)、菌落和菌細胞形態(tài)的觀察。選取不同的單個菌落接種于牛心腦浸液(BHI)瓊脂培養(yǎng)基上行耐氧實驗和細菌的次代培養(yǎng)。對純化的可疑的產(chǎn)生黑色素的G-桿菌和梭桿菌次代培養(yǎng)物行生化鑒定(反應板微量快速生化試驗),根據(jù)伯杰氏細菌學鑒定手冊確定是否為P.g和F.n。計算出P.g和F.n的檢出量,作為微生物學檢測指標。菌量測定采用一定濃度下齦下菌叢細菌菌落的形成單位(colonyformingunit,CFU)計數(shù),單位為CFU/ml,并將其轉(zhuǎn)化為對數(shù)。1.4牙槽骨吸收量的測定水平性骨吸收的測量采用改良Crawford法。在實驗前和喂飼細菌的第2、4周,微生物學檢查完成后,每組各處死大鼠5只,取下左側(cè)上頜骨,置于10%的福爾馬林中固定,漂洗并去除軟組織,保留硬組織,觀察牙槽骨吸收的情況。用體視顯微鏡測量每個磨牙的釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x,每牙測量6個位點:頰、舌側(cè)的近、中、遠6點。每牙的各位點測量值之和為該牙的總牙槽骨吸收值。1.5光鏡觀察在各觀察時間點,用鹽酸氯胺酮深度麻醉大鼠后,處死,取下整個上頜骨,組織修整后將組織塊放入10%福爾馬林中固定48h,放入15%EDTA溶液中,4℃脫鈣7d,逐級酒精脫水,常規(guī)石蠟包埋,沿牙長軸頰舌向縱切(切片厚度5μm)。常規(guī)HE染色,光鏡下觀察。1.6統(tǒng)計學方法將所得數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫,采用方差分析進行數(shù)據(jù)分析,P<0.05為有統(tǒng)計學差異。2實驗牙的材料和組織學檢查2.1微生物學檢查結(jié)果微生物學檢查顯示:接種細菌前,各組均未培養(yǎng)出P.g或F.n;2周時,N組和P1組也未培養(yǎng)出P.g或F.n;而P2組P.g的檢出量為6.20±0.57lgCFU/ml,且與N組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05),未檢出F.n;P3組P.g的檢出量為6.20±0.57lgCFU/ml,F.n的檢出量為4.36±0.62lgCFU/ml,與N組相比均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。第4周時,P1組檢出有少量F.n,P2和P3組的細菌檢出情況與2周時相比較牙周致病菌檢出量有所減少。2.2牙槽骨吸收情況肉眼觀察:各實驗組在第二周時就開始出現(xiàn)不同程度的牙槽骨吸收,4周時進一步加重,其中以高糖飼料+絲線結(jié)扎動物牙頸部+混合菌組為最重,部分實驗牙已可看到暴露的牙根;值得一提的是,接種細菌的兩組,除實驗牙(上頜第二磨牙)外,鄰牙遠離結(jié)扎線一側(cè)的牙槽骨吸收也很明顯:如圖1所示,這可能是由于本實驗采用管飼法接種細菌,鄰牙雖未用絲線結(jié)扎牙頸部,但可能有牙周致病菌的定植。各組實驗牙的總的牙槽骨吸收值見附表。2.3組織學檢查2.3.1對照組(N)光鏡觀察顯示,對照組和各實驗組在基線時大鼠牙周組織的情況基本相同:牙齦上皮結(jié)構(gòu)完整,上皮下結(jié)締組織內(nèi)見少量的炎細胞浸潤,結(jié)合上皮附著于釉牙骨質(zhì)界附近的牙表面,位置正常,為角化的復層鱗狀上皮;牙周膜纖維整齊排列;牙槽嵴頂尖銳,固有牙槽骨形態(tài)結(jié)構(gòu)完整。實驗2周和4周時,N組光鏡下觀察牙周組織情況與基線時相比無明顯變化。2.3.2高糖飼料+絲線結(jié)扎組(P1)2周時牙齦上皮糜爛,上皮釘突增生,結(jié)合上皮向根方增殖,但無明顯的牙周袋形成;結(jié)合上皮周圍有大量的中性粒細胞浸潤,伴有少量的淋巴細胞和巨噬細胞;水平組纖維開始出現(xiàn)膠原疏松、水腫、變性,纖維排列紊亂,牙周膜間隙增寬,有炎細胞浸潤;牙槽骨可見較多吸收陷窩,部分動物有牙槽嵴高度降低。見圖2。4周時結(jié)合上皮根向增生,牙周袋形成,牙周袋袋底可見淺潰瘍;增生的上皮網(wǎng)眼中炎細胞以漿細胞、淋巴細胞為主;膠原纖維破壞至主纖維的部位,有牙周袋形成,袋內(nèi)較多炎性滲出物;牙槽骨吸收明顯,破骨細胞活躍。見圖3。2.3.3高糖飼料+絲線結(jié)扎+P.g組(P2)2周時結(jié)合上皮處有潰瘍形成,上皮與牙面分離,上皮根向增殖不明顯,上皮病變以破壞為主,袋內(nèi)上皮糜爛,袋內(nèi)可見細菌團塊;上皮下炎細胞浸潤明顯,仍以中性粒細胞為主;牙周纖維破壞明顯;牙槽骨吸收明顯,有小的死骨形成;成骨活動不明顯。見圖4。4周時有明顯的牙周袋形成,結(jié)合上皮根增殖明顯,上皮層次增多,增生的上皮網(wǎng)眼內(nèi),仍有較多炎細胞浸潤,但量較2周時減少,以淋巴、漿細胞為主;牙槽骨吸收已超過根中份。2.3.4高糖飼料+絲線結(jié)扎+混合菌組(P3)2周時牙周袋形成,袋內(nèi)上皮及齦乳頭表面糜爛及潰瘍形成,結(jié)合上皮糜爛壞死,上皮增殖不明顯;袋內(nèi)可見大塊的細菌團塊;牙槽骨吸收破壞較重,有大塊死骨形成;可見較多牙骨質(zhì)吸收陷窩,陷窩內(nèi)可見破牙骨質(zhì)細胞,尤以根尖1/3為重。根分叉處大量炎細胞浸潤,膠原水腫、變性明顯。見圖5。4周時牙周袋進一步加深,上皮增生明顯,袋內(nèi)壁的病變主要在結(jié)合上皮處,炎細胞浸潤也有所減少;牙槽骨吸收已近根尖;根尖處牙骨質(zhì)破壞明顯。3實驗大鼠牙周炎模型建立方法的確定早在1964年Keyes等就利用高糖低蛋白飼料(Keyes2000)成功地誘導了地鼠典型的牙周炎的形成,其后不少學者利用改良的Keyes2000在狗及大鼠等動物身上也都成功地造成了牙周炎。絲線結(jié)扎動物牙頸部造成菌斑滯留也是一種較為常用的建立牙周炎模型的方法,周秀青等采用絲線結(jié)扎大鼠牙頸部以誘導牙周炎的形成。而接種牙周可疑致病菌也是一種較為常用的建立牙周炎動物模型的方法,Ichie等的研究表明單一致病菌雖然也能引起實驗性牙周炎,但多種致病菌協(xié)同作用可加重病情進展和疾病的嚴重性。上述各種方法均能誘導牙周炎的形成,但存在實驗時間較長的缺點,而將以上方法中的一種或兩種聯(lián)合起來作用于動物,能更早地獲得牙周炎模型。本研究就高糖飼料加牙頸部絲線結(jié)扎與高糖飼料加牙頸部絲線結(jié)扎加接種牙周致病菌建立大鼠牙周炎模型的方法進行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn):高糖飼料加牙頸部絲線結(jié)扎組(P1組)在第2周時的病變主要以牙齦的急性炎癥為主,尚未形成明顯的牙周炎;4周時牙齦的病理改變?yōu)槁匝装Y過程,有牙周袋形成及牙槽骨的吸收,表明采用此法建立牙周炎的動物模型,4周是觀察牙周炎病變較適宜的時期。而P2組在2周時,牙齦亦表現(xiàn)為一個急性炎癥反應,牙齦上皮可見較重的糜爛甚至潰瘍形成,牙槽骨破壞明顯,較多動物可見死骨形成,是一個較典型的急性重度牙周炎活動期的病理表現(xiàn);而4周時,牙齦根向增生明顯,有深的牙周袋形成,袋內(nèi)壁上皮層次明顯增多,上皮完整性有了一定程度的恢復,潰瘍和糜爛已不多見,炎細胞也以淋巴、漿細胞等慢性炎癥細胞