姜辣素抗小鼠胃潰瘍作用及其機制研究

姜辣素抗小鼠胃潰瘍作用及其機制研究

潰瘍是一種慢性潰瘍，發(fā)生在門戶和幽門之間。這是一種常見的臨床疾病，通常是罕見的。據(jù)統(tǒng)計，約11%的人一生中患有疾病。此病若不能及時對癥治療很容易發(fā)生穿孔、出血、梗阻以及胃潰瘍癌變,給患者身心帶來極大痛苦?，F(xiàn)代用來控制胃潰瘍的方法主要是使用質(zhì)子泵抑制劑和組胺H2受體阻滯劑來抑制胃酸分泌,但從長期的臨床治療上來看有很多不利影響和復發(fā)的報告。生藥姜具有開胃止嘔,化痰止咳,發(fā)汗解表的性能,姜辣素是生藥姜中一些具有辣味物質(zhì)的總稱。其主要成分為6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚。本文作者應用了現(xiàn)代藥理學研究手段,通過考察姜辣素對幽門結(jié)扎法致胃潰瘍模型和阿司匹林致胃潰瘍模型的作用,初步探討其作用機制。1實驗儀器與試劑SX721分光光度計(山東高密彩虹分析儀器有限公司),J2-HS型低溫超速離心機(美國BECKMAN公司),JC-1200γ放射免疫計數(shù)器(中國科技大學科技實業(yè)總公司中家光電儀器分公司),RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠),微型植物試樣粉碎機(北京市永光明醫(yī)療儀器廠),202-2AB型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司),KH-250B型超聲清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器廠)。姜辣素(由沈陽藥科大學中藥學院提供),體內(nèi)實驗時,用體積分數(shù)為40%的聚乙二醇400(polyethyleneglycol400,PEG400)溶液配制,米索前列醇(misoprostol,MPS,湖北葛店人福藥業(yè)有限責任公司,批號:081207),酚酞(天津市博迪化工有限公司,批號:20050607),氫氧化鈉(沈陽市正信高科技研究所試劑部,批號:20050327),阿利新蘭8GX(美國Amresco公司),檸檬酸(沈陽正信高科技研究所試劑部,批號:20040327),磷酸氫二鈉(廣東汕頭市西隴化工廠,批號:0503071),6-keto-PGF1α放免試劑盒(中國人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心,批號:200908),消炎痛EDTA·Na2(中國人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心)。昆明種小鼠,體質(zhì)量25～30g,雌雄各半,由沈陽藥科大學實驗動物中心提供,質(zhì)量一級合格,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(遼)2003-008。2方法2.1姜辣素的制備2.1.1超聲輔助提取取鮮生姜若干置于干燥箱中于60℃干燥至恒質(zhì)量,用粉碎機粉碎過0.3mm篩,粉碎過的樣品置于燒杯中,以體積分數(shù)為60%的乙醇溶液為溶劑,質(zhì)量濃度80g·L-1條件下超聲處理15min,布氏漏斗抽濾,取濾液,低壓濃縮回收乙醇,得姜辣素粗提物。2.1.2洗脫溶液濃縮處理好的大孔吸附樹脂,用量為m(姜辣素粗提物)∶m(干樹脂)=4∶100,洗脫溶劑為V(正己烷)∶m(乙醇)=7∶3,洗脫速度:0.4mL·min-1,將洗脫得到的洗脫液濃縮,得姜辣素。經(jīng)分析姜辣素的純度質(zhì)量分數(shù)為63.44%,姜辣素的主要成分為6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、姜酮及姜烯酚。其中,6-姜酚約占53%,8-姜酚約占13%,10-姜酚約占30%,姜酮和姜烯酚低于1%。2.2抗幽門扎法對大鼠胃不好2.2.1小鼠胃損傷指數(shù)gk-1、姜辣素檢測昆明種小鼠60只,體質(zhì)量25～30g,雌雄各半,隨機分為6組,即溶劑對照組和模型組(灌胃給予體積分數(shù)為40%的PEG400溶液)、米索前列醇組(0.14mg·kg-1)、姜辣素低劑量組(73mg·kg-1)、姜辣素中劑量組(145mg·kg-1)、姜辣素高劑量組(290mg·kg-1)。每天灌胃給藥1次,連續(xù)7d,第六天給藥后禁食24h,自由飲水。末次給藥1h后,除溶劑對照組外,其他各組小鼠乙醚淺麻醉,行幽門結(jié)扎術。術后20h處死小鼠,取出全胃,觀察胃黏膜損傷情況,并計算各組小鼠胃損傷指數(shù)及潰瘍抑制率。判定標準:點狀潰瘍(直徑小于1mm的潰瘍),3個點計1分;長條狀出血潰瘍(直徑大于1mm的潰瘍),寬度在1mm之內(nèi)者則按長度計分每1mm長計1分,如寬度大于1mm者按長度加倍計分。潰瘍抑制率(%)=(模型組潰瘍指數(shù)-給藥組潰瘍指數(shù))/模型組潰瘍指數(shù)×100%。2.2.2保肝活性氧測定昆明種小鼠50只,體質(zhì)量25～30g,雌雄各半,隨機分為5組,即模型組(灌胃給予體積分數(shù)為40%的PEG400溶液)、米索前列醇組(0.14mg·kg-1)、姜辣素低劑量組(73mg·kg-1)、姜辣素中劑量組(145mg·kg-1)、姜辣素高劑量組(290mg·kg-1)。小鼠每天灌胃給藥1次,連續(xù)7d,第六天給藥后禁食24h,自由飲水。末次給藥1h后,各組小鼠乙醚淺麻醉,剖開腹壁,行幽門結(jié)扎術。手術20h后結(jié)扎賁門,處死小鼠,取出全胃,將胃液倒入試管中,離心10min(3000r·min-1),取上清液進行胃液總酸度、胃蛋白酶活性和游離黏液量的測定。胃液總酸度的測定方法:取上清胃液0.2mL,加0.2mL蒸餾水稀釋,稀釋液加10g·L-1酚酞50μL,以0.01mol·L-1NaOH滴定至終點(溶液顯粉紅色,且30s內(nèi)不變色),記錄消耗的NaOH的體積,計算胃液總酸度。胃液總酸度(mmol·L-1)=NaOH消耗量(mL)×50。胃蛋白酶活性的測定方法:取上清胃液0.2mL置于具塞試管中,加0.05mol·L-1鹽酸稀釋至3.0mL。將預先做好的兩根長2.0cm的蛋白管(取內(nèi)徑為1.0mm的玻璃毛細管,灌滿新鮮蛋清,放入85℃水中,待蛋清凝固后取出、冷卻,截去兩端透明的部分)置于試管中,將試管放入37℃恒溫水浴中孵育24h之后取出,用游標卡尺測量蛋白管兩端透明部分的長度(mm),求出透明部分長度的平均值,計算胃蛋白酶活性。胃蛋白酶活性單位(mol·s-1)=平均值2×16。游離黏液量的測定方法:取上清胃液0.2mL,加10g·L-1阿利新蘭溶液0.02mL,pH5.8檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液0.66mL,再加蒸餾水至1.0mL,混勻,于20℃室溫靜置24h后,離心10min(2500r·min-1),取上清液,于可見分光光度計615nm波長處測定吸光度值(OD值)?？瞻坠転閜H5.8檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液,標準管為0.2g·L-1的阿利新蘭溶液。計算游離黏液所結(jié)合染料量。游離黏液量(g·L-1)=1.0-樣品管OD值/標準管OD值。2.3阿司匹林對大鼠胃的影響2.3.1米索自組織米索前藥昆明種小鼠60只,體質(zhì)量25～30g,雌雄各半,隨機分為6組,即溶劑對照組和模型組(灌胃給予體積分數(shù)為40%的PEG400溶液)、米索前列醇組(0.14mg·kg-1)、姜辣素低劑量組(73mg·kg-1)、姜辣素中劑量組(145mg·kg-1)、姜辣素高劑量組(290mg·kg-1)。給藥0.5h后,模型組、米索前列醇組、低劑量組、中劑量組、高劑量組分別灌胃給予阿司匹林100mg·kg-1,小鼠每天灌胃給藥1次,連續(xù)7d,第六天給藥后禁食24h,自由飲水。末次給藥1h后,處死小鼠,迅速剖取胃,洗凈內(nèi)容物,觀察胃黏膜損傷情況,并計算各組小鼠胃損傷指數(shù)。判定標準同“2.2.1”條。2.3.2胃壁結(jié)合染料量的測定昆明種小鼠60只,雌雄各半,分組及給藥方法同“2.2.1”條。末次給藥1h后,將小鼠處死,迅速剖取胃,洗凈內(nèi)容物,于濾紙上吸干水分,將整個胃組織浸于用pH5.8檸檬酸-磷酸二氫鈉配制的阿利新蘭溶液(0.2g·L-1)8.0mL中,室溫下靜置3h,而后離心10min(1500r·min-1),取上清液進行比色測定。標準管為0.2g·L-1的阿利新蘭溶液。計算胃壁結(jié)合染料量。結(jié)合染料量(mg)=1.6-(對照管OD值/標準管OD值)×1.6。2.3.3小鼠血清學檢測昆明種小鼠60只,雌雄各半,分組及給藥方法同“2.2.1”條。末次給藥1h后經(jīng)小鼠眼球后靜脈叢取血1.0mL,注入含有消炎痛EDTA·Na2的試管中,混勻,離心15min(3500r·min-1),分離血漿。按血漿6-keto-PGF1α試劑盒說明進行操作,用JC-1200γ放射免疫計數(shù)器進行放免測定。2.4統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)以均值加減標準差(ˉx±s)表示,采用SPSS13.0軟件應用組間t-檢驗進行統(tǒng)計學分析,以P<0.05為顯著性差異。3結(jié)果3.1抗幽門結(jié)防止老鼠潰瘍3.1.1姜辣素對小鼠推進理成單、確立潰瘍抑制的實驗結(jié)果實驗結(jié)果顯示:模型組小鼠胃潰瘍(Ulcerindex,UI)指數(shù)高,損傷嚴重,與溶劑對照組相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.001);姜辣素各組小鼠UI指數(shù)低,損傷不嚴重,與模型組相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.001),潰瘍抑制(Inhibition,I)率隨劑量增大而提高。實驗結(jié)果見表1。a—P<0.001comparedwithcontrol;b—P<0.01;c—P<0.001comparedwithmodel3.1.2兩組小鼠胃腸總酸度比較,見表1實驗結(jié)果顯示:姜辣素各組小鼠胃液(gastricjuice,GJ)分泌量明顯減少,與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.001);姜辣素中劑量組和高劑量組小鼠胃液總酸度(gastrictotalacidity,GTA)明顯降低,與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.001)。與模型組比較,姜辣素各組小鼠胃蛋白酶(pepsin,P)活性無顯著差異(P>0.05)。實驗結(jié)果見表2。a—P<0.05;b—P<0.01;c—P<0.001comparedwithmodel3.1.3兩組病料游離處理量比較實驗結(jié)果顯示:姜辣素中劑量組和高劑量組小鼠胃液游離黏液量(freemucus,FM)增加,與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.001)。實驗結(jié)果見表2。3.2阿司匹林對大鼠胃的影響研究3.2.1對小鼠胃損傷指數(shù)的影響實驗結(jié)果顯示:阿司匹林模型組小鼠胃損傷指數(shù)高,損傷嚴重,與溶劑對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001);姜辣素中劑量組和高劑量組小鼠胃損傷指數(shù)低,損傷不嚴重,與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.001)。實驗結(jié)果見表3。3.2.2兩組小鼠胃腸結(jié)合效率4.0.05的比較實驗結(jié)果顯示:阿司匹林模型組小鼠胃液結(jié)合黏液量(mucus,M)低,與溶劑對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);姜辣素高劑量組小鼠胃液結(jié)合黏液量高,與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實驗結(jié)果見表3。3.2.3小鼠血漿6-keto-pgf1水平實驗結(jié)果顯示:阿司匹林可使小鼠血漿6-keto-PGF1α水平降低,較溶劑對照組有顯著差異(P<0.001)。姜辣素組小鼠血漿6-keto-PGF1α水平較模型組顯著升高(P<0.001)。實驗結(jié)果見表3。a—P<0.05;b—P<0.001comparedwithcontrol;c—P<0.05;d—P<0.01;e—P<0.001comparedwithmodel4姜辣素對胃黏膜酶的活性目前關于胃潰瘍發(fā)病機制的學說有很多,其中shay等人提出的“天平學說”——攻擊因子與防御因子失衡最為合理,攻擊因子主要指胃酸、胃蛋白酶等;防御因子主要包括胃黏膜血流、碳酸氫鹽、黏液分泌、細胞膜的完整性、細胞的再生等。本文作者采用幽門結(jié)扎法致潰瘍模型,其機制是通過刺激幽門胃竇黏膜的壓力感受器,引起迷走神經(jīng)反射,通過促胃液素,作用于壁細胞,引起胃液分泌。又由于結(jié)扎后胃液不能順利進入十二指腸,而使胃液滯留于胃內(nèi)。胃液中的胃酸可以激活胃蛋白酶原,使之轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘奈傅鞍酌?。當胃腔中H+在局部大量聚集,分解黏液層中的碳酸氫鹽,最終破壞胃黏膜上皮細胞之間的緊密連接,削弱胃黏膜屏障,從而形成潰瘍、糜爛或出血。從本文作者研究姜辣素的實驗結(jié)果可以看出:姜辣素各劑量組小鼠潰瘍指數(shù)顯著低于模型組,不僅如此,姜辣素中高劑量組的胃液分泌量與胃液總酸度也有明顯降低,胃蛋白酶活性也有降低的趨勢,證明姜辣素對于胃酸和胃蛋白酶攻擊因子加強確實有抑制作用;另外,姜辣素中高劑量能顯著促進胃液游離黏液量的分泌,胃液中的游離黏液雖對胃黏膜已無保護作用,但游離黏液的含量反應了黏膜上皮細胞黏液更新速度的快慢。實驗結(jié)果提示姜辣素可使胃黏膜表面黏液的更新速度加快,胃黏液分泌增加,胃黏液-碳酸氫鹽屏障功能增強,使胃黏膜自身防御因子水平提高,起到抗損傷的作用。阿司匹林致胃潰瘍的形成是由于阿司匹林抑制胃黏膜環(huán)氧化酶,使前列腺素(prostag