人類基因組(下)

（三）DNA多態(tài)性與個(gè)性化醫(yī)療在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展史上，人們大致經(jīng)歷了三次革命。第一次醫(yī)學(xué)革命主要是發(fā)現(xiàn)和描述疾病，并試圖用現(xiàn)代科學(xué)來解釋、查明疾病的病因；第二次醫(yī)學(xué)革命是探明疾病發(fā)生的分子機(jī)理，即采用生物化學(xué)、生物物理等一系列新興學(xué)科知識(shí)，從分子水平上揭示疾病的起因，并由此開發(fā)出針對(duì)某一類疾患的特效藥，我們今天仍處于這一革命的高峰。第三次醫(yī)學(xué)革命是1990年代中期出現(xiàn)的醫(yī)學(xué)個(gè)性化醫(yī)療的新趨向。1隨著分子生物學(xué)，特別是人類基因組研究的不斷深化，人們認(rèn)識(shí)到疾病的發(fā)生、發(fā)展往往與患者特定的遺傳背景有關(guān)。為此，在今后的疾病診斷和治療中，醫(yī)生將更多考慮患者的遺傳背景。研究遺傳、環(huán)境因素對(duì)人體健康的影響－疾病易感性2個(gè)體對(duì)環(huán)境致病因素的易感性有著很大的差異，因此患病的概率也不同統(tǒng)計(jì)數(shù)字表明，中國人患肝癌的比例大大高于其他種族，即使移居海外已經(jīng)幾代的華人，其患肝癌的比例仍明顯高于其他民族人群。反過來，白人中皮膚癌的罹患率相當(dāng)高，而中國這一病癥的發(fā)生率則低到可以忽略不計(jì)。日本是胃癌高發(fā)區(qū)：Japanese:1.00BorninJapan:0.72BorninUSA:0.38USwhites:0.173正常人體細(xì)胞中有癌基因和抑癌基因。癌基因?qū)S持細(xì)胞正常生理功能是必需的。當(dāng)癌基因突變激活或抑癌基因突變失活，就會(huì)引發(fā)腫瘤。化學(xué)誘變劑和輻射會(huì)損傷DNA，使癌基因和抑癌基因發(fā)生突變。4細(xì)胞中有一部分代謝酶滅活誘變劑，由于遺傳變異，有的人這部分代謝酶活性低，就較易得腫瘤，編碼這部分活性低的代謝酶基因就成為腫瘤易感基因；相反，有的誘變劑需另一部分代謝酶活化，編碼這部分活性高的代謝酶基因就成為腫瘤易感基因；細(xì)胞中有一系列修復(fù)DNA損傷的酶，編碼活性低的修復(fù)酶基因，就成為腫瘤易感基因。5因此，腫瘤的發(fā)生就和許多編碼代謝酶、DNA損傷修復(fù)酶的基因有關(guān)，還和環(huán)境化學(xué)、物理因素有關(guān)，為多基因病。例如對(duì)于某種腫瘤，與其發(fā)生相關(guān)的基因有許多（代謝酶基因、DNA損傷修復(fù)基因），SNP也有許多，根據(jù)大量的文獻(xiàn)報(bào)道，進(jìn)行綜合分析，選取差異顯著的一些SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測，就可以作出風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。6個(gè)體對(duì)藥物的敏感度－個(gè)體化用藥目前，正在興起的藥物基因組學(xué)研究遺傳因素對(duì)藥物作用的影響和不同基因型個(gè)體對(duì)藥物反應(yīng)的差異，從而為臨床有針對(duì)性地合理用藥，及根據(jù)不同基因型群體對(duì)藥物的反應(yīng)來改進(jìn)藥物設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)，促進(jìn)了個(gè)體化用藥的進(jìn)程。伊立替康（irinotecan）是治療結(jié)直腸癌的化療藥，由尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT1A1）代謝。伊立替康有嚴(yán)重的副作用：白細(xì)胞減少和嚴(yán)重腹瀉。72005年8月美國FDA批準(zhǔn)第一例通過檢測UGT1A1多態(tài)指導(dǎo)伊立替康劑量。UGT1A1野生型在啟動(dòng)子TATAbox區(qū)域6個(gè)TA重復(fù)，變異體UGT1A1*28是7個(gè)TA重復(fù)，導(dǎo)致活性降低。硝酸甘油是治療心絞痛的特效藥。線粒體醛脫氫酶2（ALDH2）負(fù)責(zé)NO的形成，而后者是硝酸甘油發(fā)揮作用所必需的。ALDH2第12個(gè)外顯子在中國人中存在G→A多態(tài)，導(dǎo)致第508位氨基酸由谷氨酸變成賴氨酸，而使ALDH2失效。研究表明，在80個(gè)中國病人中，有21個(gè)對(duì)硝酸甘油無效。8Gefitinib（吉非替尼），商品名：Iressa（易瑞沙），生產(chǎn)公司：AstraZeneca（阿斯利康）在人類多種上皮細(xì)胞源性的腫瘤組織中都存在EGFR（表皮生長因子受體）的異常激活，使其正常功能失控，從而引起細(xì)胞異常增生和轉(zhuǎn)移。已知多種實(shí)體瘤，如非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和頭頸癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等的發(fā)生都與腫瘤組織中EGFR的異?；罨嘘P(guān)。Gefitinib抑制表皮生長因子受體酪氨酸激酶（EGFR-TK）活性，截?cái)郋GFR生成信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，從而遏止細(xì)胞的異常增生和轉(zhuǎn)移，起到抗腫瘤作用。

Gefitinib只對(duì)表皮生長因子受體基因突變腫瘤有效。9非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中研究表明：突變在腺癌中比其它NSCLC中頻率高（15/70or21％vs1/49or2％）；在女性中比男性中頻率高（9/45or20％vs7/74or9％）；在日本患者中比美國患者中頻率高（15/58or26％，腺癌中14/41or32％vs1/61or2％，腺癌中1/29or3％）。在日本女性腺癌患者中基因突變頻率最高（8/14or57％）。10兩年前，西班牙已在臨床上試驗(yàn)性推廣個(gè)性化治療，采用的也是基因技術(shù)西班牙婦女瑪爾塔和羅莎同時(shí)被診斷出患了乳腺癌，經(jīng)過治療病情得到控制。但是醫(yī)生給她們使用了不同的藥物?，敔査玫乃幬锝蠺rastuzumab，重組DNA人單克隆抗體。而羅莎使用的是Gefitinib，一種專門用來治療頑固性家族遺傳乳腺癌的藥物。她們兩人患上乳腺癌的病因完全不同，因而醫(yī)生針對(duì)其各自病情采用了不同的藥物。對(duì)瑪爾塔和羅莎來說，醫(yī)生治愈的不是“通?！钡陌┌Y，而是屬于“她們”自己的癌癥。11目前已知人類表皮生長因子受體－2（HER－2）是目前認(rèn)識(shí)較為清楚的與乳腺癌關(guān)系密切的人類癌基因，它在乳腺癌中的高表達(dá)往往預(yù)示著雌激素受體（ER）陰性、易有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化差，預(yù)后不佳。隨著對(duì)HER－2研究的深入，它已經(jīng)成為乳腺癌特異性治療的靶分子之一。12已被FDA批準(zhǔn)的曲妥珠單抗（Trastuzumab）是重組DNA人單克隆抗體。曲妥珠單抗選擇性作用于HER－2，具有高度親和力，具有高度靶向性，只對(duì)癌細(xì)胞起作用，而對(duì)正常細(xì)胞的殺傷較小，是當(dāng)代乳腺癌靶向治療的代表性藥物。13基礎(chǔ)研究表明，約有25％～30％的乳腺癌患者HER－2有基因改變，促使腫瘤細(xì)胞HER－2增加。曲妥珠單抗可選擇性地與HER－2牢固結(jié)合，抑制癌細(xì)胞的增生，適用于HER－2過度表達(dá)的乳腺癌患者。141、功能克隆：

（四）疾病相關(guān)基因的定位與克隆從疾病出發(fā)，鑒定功能蛋白質(zhì)，從蛋白質(zhì)再鑒定、克隆致病基因的方法，稱為功能克隆。克?。ㄖ虏。┗虻囊环N策略。收集所要克隆的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物及其功能的信息，用以分離基因，并對(duì)基因進(jìn)行定位。15性狀（疾?。┑鞍踪|(zhì)產(chǎn)物（生物學(xué)功能）從氨基酸序列出發(fā)設(shè)計(jì)DNA引物，從文庫調(diào)取基因得到基因序列染色體定位疾病基因功能分析異常基因的產(chǎn)物（蛋白質(zhì)），純化蛋白質(zhì)，進(jìn)行氨基酸序列測定，據(jù)此推測可能的核苷酸序列，合成寡核苷酸探針，然后用探針從cDNA文庫中篩選對(duì)應(yīng)的編碼基因。從細(xì)胞中提取mRNA,建立含有大量cDNA的集合體，并將它們連接、克隆到特殊的載體中，這個(gè)cDNA克隆的集合體就稱為cDNA文庫。16直到20世紀(jì)80年代，研究人類醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的科學(xué)家只能通過仔細(xì)分析患者疾病的病理生理學(xué)期望發(fā)現(xiàn)易感基因。血紅蛋白基因突變引起血紅蛋白病是第一個(gè)在分子醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)水平定性的人類疾病。血紅蛋白病特別便于研究，因?yàn)榧膊〉牟±韺W(xué)可以定位于紅細(xì)胞，相應(yīng)的血紅蛋白可以通過收集外周血得到。絕大部分分子病、遺傳性代謝缺陷（酶）病如白化病、苯丙酮尿癥和黑尿病等，都是采取的這一策略。不幸的是，這種方法僅能用于有限的、可以直接測定生化缺陷的人類致病基因。172、定位克隆到20世紀(jì)80年代后期，現(xiàn)代分子醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)強(qiáng)有力的手段，使僅通過圖譜位置定位人類疾病易感基因成為可能，而不必借助任何功能信息。這種方法稱為定位克隆。疾病－染色體定位－基因序列－mRNA－蛋白質(zhì)/生物學(xué)功能18又稱為“逆向遺傳學(xué)”，始于20世紀(jì)80年代后期利用遺傳連鎖或細(xì)胞遺傳學(xué)定位技術(shù)將致病基因定位于染色體的特定區(qū)帶。定位：通過連鎖分析找出與目的基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記在染色體上的位置。克?。簭亩ㄎ坏娜旧w區(qū)段內(nèi)分離克隆所要的基因，并進(jìn)一步研究其功能。19疾病遺傳標(biāo)記，染色體定位基因序列mRNAcDNA蛋白質(zhì)產(chǎn)物生物學(xué)功能功能

疾病

基因2、定位克隆20定位克隆有兩個(gè)主要瓶頸，第一是應(yīng)用細(xì)胞遺傳學(xué)或連鎖分析方法將基因定位于特定的染色體區(qū)域，第二是從該區(qū)域內(nèi)所有可能候選基因中找出正確的基因。定位克隆鑒定的第一批基因利用了特定基因座的染色體畸變。杜氏（Duchenne）肌營養(yǎng)不良（DMD）基因的克隆是一個(gè)重要的例子。21DMD是X連鎖隱性遺傳病。經(jīng)過大量的細(xì)胞遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，DMD患者中大量存在Xp21區(qū)域的易位和缺失，因此推斷DMD基因最有可能定位于Xp21。兩個(gè)研究小組分別用兩種不同的方法克隆了DMD基因。DMD患者每個(gè)病例受累的常染色體不同，但在X染色體上的斷裂點(diǎn)總是p21區(qū)域。

22一組分析了一例DMDX常染色體易位，該易位將X染色體序列與21號(hào)染色體短臂區(qū)域連在一起。21號(hào)染色體短臂區(qū)域含有核糖體基因，即編碼核糖體RNA的重復(fù)序列。因?yàn)槟切┬蛄惺且阎?，所以克隆X染色體的DNA斷裂點(diǎn)已成為可能。正如期望的一樣，這段X染色體序列位于DMD基因內(nèi)。另一研究組分析了有Xp21.2微小缺失的男孩的DNA，該男孩無任何遺傳缺陷家族史，卻被發(fā)現(xiàn)同時(shí)患有DMD、慢性肉芽腫（CGD，為一種白細(xì)胞缺陷，嚴(yán)重影響抗感染能力）和其他兩種X連鎖性狀。這四種X連鎖疾病的同時(shí)發(fā)生引起仔細(xì)的細(xì)胞遺傳學(xué)研究，最終發(fā)現(xiàn)了Xp21.2的微小缺失。23研究人員先對(duì)正常的、母親的基因組DNA進(jìn)行MboI酶切，使基因組DNA變成短的、帶有GATC粘性末端的小片段；再將這些小片段變性解鏈后與200倍以上、缺失片段的患者DNA片段進(jìn)行雜交?；颊叩腄NA經(jīng)過超聲波隨機(jī)打斷，故其末端缺乏特異的GATC粘性末端。由于患者的Xp21.2有缺失，在雜交時(shí)就沒有相應(yīng)的片段與來自正常母親的該區(qū)域的DNA片段雜交形成雙鏈，因此該區(qū)域的DNA片段只來自母親，所以在復(fù)性時(shí)就只能自身結(jié)合，這樣其兩端仍具有GATC粘性末端。24而其他區(qū)域的DNA片段由于患者DNA片段是過量的，幾乎所有來自正常個(gè)體的粘性末端片段都會(huì)與患者中相應(yīng)的片段雜交形成雜合雙鏈，即一端有粘性末端，另一端沒有。再對(duì)這些雜交后的雙鏈與一個(gè)用BamHI酶切后的載體（具有相同的GATC粘性末端）進(jìn)行克隆。結(jié)果就只能克隆到兩端皆為粘性末端的片段，即只來自正常個(gè)體而患者不具有的片段。25亨廷頓（Huntington）舞蹈癥是一種常染色體顯性遺傳病，盡管過去進(jìn)行了多年的研究，通過比較亨廷頓患者與正常人的組織，仍未發(fā)現(xiàn)任何特殊的蛋白質(zhì)異常。因此，沒有任何構(gòu)成亨廷頓病基礎(chǔ)的遺傳缺陷線索可進(jìn)行功能克隆。同時(shí)，在任何患者均未發(fā)現(xiàn)特定區(qū)域的染色體異常。26亨廷頓病是第一個(gè)通過系統(tǒng)篩查多態(tài)性遺傳標(biāo)記，進(jìn)行連鎖分析而定位的遺傳病，這種方法通常稱為基因組掃描。由于亨廷頓病是常染色體顯性遺傳，外顯率高，并容易獲得大家系的特點(diǎn)而成為首選研究目標(biāo)。因此，研究人員開始大量收集家系資料和開發(fā)一系列DNA多態(tài)標(biāo)記探針，希望在發(fā)現(xiàn)某種連鎖前試用100-300個(gè)探針。幸運(yùn)的是，試用的第12個(gè)探針，稱為G8與亨廷頓病基因座（HD）緊密連鎖。G8標(biāo)記位于4號(hào)染色體短臂頂端，說明HD位點(diǎn)也一定接近該位置。27盡管G8和HD間的連鎖關(guān)系在1983年首先報(bào)道，完成定位克隆過程到鑒定亨廷頓病致病基因和亨廷頓病遺傳缺陷的特征描述，又花費(fèi)了十年。亨廷頓病是由HD蛋白氨基末端三核苷酸CAG動(dòng)態(tài)重復(fù)引起。CAG重復(fù)范圍在正常的染色體為10-30拷貝，在HD染色體為36-121拷貝。CAG重復(fù)的長度與癥狀出現(xiàn)的年齡一般相關(guān)（重復(fù)的長度越長，預(yù)示出現(xiàn)癥狀越早）。現(xiàn)在十年又過去了，HD蛋白的功能尚不清楚。HD基因的克隆為最終認(rèn)清HD的病理生理學(xué)和開發(fā)新的治療方案提供了強(qiáng)有力的研究新手段。28

A-1型短指（趾）癥：法拉比（Farabee）1903年在他的哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士畢業(yè)論文中首先報(bào)道了，即世界上第一例孟德爾常染色體顯性遺傳病，以后作為遺傳學(xué)的經(jīng)典例子被全世界的生物學(xué)和遺傳學(xué)教材廣泛引用。

賀林實(shí)驗(yàn)室利用布依族、苗族和漢族的三個(gè)A-1型短指（趾）癥大家系，對(duì)該病的致病基因進(jìn)行了精確定位（位點(diǎn)定在2q35-36區(qū)）、克隆，并首次發(fā)現(xiàn)了人IHH基因和該基因上的三個(gè)突變位點(diǎn)是導(dǎo)致A-1型短指（趾）癥的直接原因。29301、遺傳病診斷

（五）疾病診斷、防治用醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)手段可從細(xì)胞遺傳學(xué)、DNA水平診斷遺傳病。脆性X染色體綜合癥：脆性X染色體綜合癥是常見的遺傳疾病之一，發(fā)病率在男性約為1/1250，在女性約為1/2000，沒有明顯的人種特異性。其主要臨床表現(xiàn)為不同程度的智力低下。從臨床癥狀很難區(qū)分脆性X染色體綜合癥與其它遺傳性智力低下，如Down氏綜合癥的區(qū)別。細(xì)胞遺傳學(xué)診斷是鑒別該病的指標(biāo)之一。31患者的外周血淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)，如培養(yǎng)基缺乏葉酸或胸腺嘧啶，約10%—40%的患者，其X染色體的帶Xq27.3不被染色，如同染色體發(fā)生了斷裂。與脆性X染色體綜合癥有關(guān)的基因已被克隆，并被命名為FMR1。脆性X染色體綜合癥為三連體重復(fù)疾病之一。該基因第一外顯子5‘非翻譯區(qū)有一個(gè)三核苷酸重復(fù)序列（CGG）n,CGG重復(fù)序列的長短在人群中具有多態(tài)性，正常人為6—50個(gè)CGG重復(fù)序列。脆性X染色體綜合癥患者含有230—1000個(gè)重復(fù)序列，稱完全突變。CGG重復(fù)序列在約50—230之間為前突變狀態(tài)。32用PCR和DNA印跡法可以診斷正常、前突變和完全突變個(gè)體。攜帶前突變的女性不表現(xiàn)癥狀，但在傳遞給子代時(shí)重復(fù)序列進(jìn)一步延長，達(dá)到完全突變的長度，其子代出現(xiàn)癥狀。但是，攜帶前突變的男性將重復(fù)序列傳給子代時(shí)，不出現(xiàn)進(jìn)一步延長。當(dāng)母親減數(shù)分裂時(shí)，從前突變擴(kuò)展到全突變的風(fēng)險(xiǎn)與重復(fù)次數(shù)成比例。當(dāng)重復(fù)次數(shù)小于70時(shí)，風(fēng)險(xiǎn)低于20%；當(dāng)重復(fù)次數(shù)大于90時(shí)，風(fēng)險(xiǎn)大于99%。33200年懸案一朝了斷美國第三任總統(tǒng)托馬斯.杰弗遜。據(jù)傳，1802年杰弗遜在喪偶后與黑人女管家海敏斯有染，且有一私生子伊斯通。1998年，美國一個(gè)著名的分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢查了有關(guān)人員Y染色體上的序列，了斷了這樁公案。杰弗遜兩個(gè)堂兄弟的5名男性后裔Y染色體，海敏斯與其丈夫所生大兒子5名男性后裔Y染色體，伊斯通男性后裔Y染色體DNA序列比對(duì)。伊斯通男性后裔Y染色體DNA序列與杰弗遜家系相同，不同于海敏斯與其丈夫所生大兒子家系。342、產(chǎn)前診斷

產(chǎn)前診斷的目的是當(dāng)未來父母生育受累子女的風(fēng)險(xiǎn)極高時(shí)，給他們提供一種無受累子女的安全保障，在一定程度上降低某種特定疾病的風(fēng)險(xiǎn)概率。產(chǎn)前診斷運(yùn)用損傷性（羊膜穿刺術(shù)、絨毛采樣、經(jīng)皮采血）和非損傷性方法（超聲診斷技術(shù)）。351）、羊膜穿刺術(shù)羊膜穿刺術(shù)即從羊水中抽取少量液體（通常為20ml），其中含有從皮膚、消化道、呼吸道及泌尿生殖道內(nèi)壁上皮脫落的胎兒細(xì)胞。羊水中的細(xì)胞可離心收集直接分析或進(jìn)行培養(yǎng)后再分析。羊膜穿刺術(shù)通常在妊娠16周進(jìn)行。36羊膜穿刺術(shù)適應(yīng)癥：（1）高齡婦女，通常限定為35歲以上的妊娠婦女，這個(gè)年齡Down氏綜合癥及其它染色體三體型的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。（2）染色體異常家族史、以前出生的孩子有染色體三體型的既往史或已知的平衡易位攜帶者。（3）孟德爾式遺傳疾病。37（4）產(chǎn)前三聯(lián)篩查異常：在母體血清中同時(shí)檢測甲胎蛋白、絨毛膜促性腺激素和雌三醇時(shí)，在35歲以下的婦女中可檢出50%-60%Down氏綜合癥出生嬰兒。由于對(duì)35歲以下的婦女一般不作常規(guī)的產(chǎn)前診斷，而現(xiàn)在75%Down氏綜合癥出生嬰兒發(fā)生在這一年齡組婦女身上，因此對(duì)于Down氏綜合癥來說，產(chǎn)前三聯(lián)篩查是一種重要的遺傳篩查試驗(yàn)。產(chǎn)前三聯(lián)篩查異常者(甲胎蛋白、雌三醇異常降低，絨毛膜促性腺激素異常增高)，需做羊膜穿刺術(shù)確診。382）絨毛采樣（CVS）這種技術(shù)利用一個(gè)精細(xì)而有彈性的聚乙烯導(dǎo)管在超聲探測儀監(jiān)視下有子宮頸進(jìn)入子宮腔，吸取少量胎兒絨毛組織，胎兒的絨毛組織必須仔細(xì)地與母體組織分離開，并且可以用多種方法檢測。絨毛采樣通常在懷孕9-12周時(shí)進(jìn)行，時(shí)間比羊膜穿刺術(shù)早，但操作失敗及胎兒流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)略有增加。393）經(jīng)皮采血（PUBS）胎兒的血液可在妊娠大約18周時(shí)采到，在超聲波探測儀監(jiān)視下將針插入臍帶中抽取，稱經(jīng)皮采血，用于快速核型鑒定。