漢防己甲素與酮康唑?qū)Π啄钪榫w外抗真菌活性的比較

漢防己甲素與酮康唑?qū)Π啄钪榫w外抗真菌活性的比較

近年來，細(xì)菌感染的發(fā)病率和死亡率逐年增加，尤其是白色桿菌。唑類藥物因其不良反應(yīng)少、口服生物利用度高、抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是治療念珠菌感染的一線藥物。但隨著唑類藥物長(zhǎng)期、廣泛應(yīng)用,耐藥菌株有明顯增多的趨勢(shì),已經(jīng)成為困擾臨床的一個(gè)重要問題。我們發(fā)現(xiàn),天然藥用植物粉防己根的雙芐基異喹啉類化合物漢防己甲素(tetrandrine,TET)對(duì)氟康唑抗白念珠菌、聯(lián)苯芐唑或益康唑抗毛癬菌屬活性有增效作用,其增效機(jī)制與抑制藥物外排泵相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。為進(jìn)一步研究TET對(duì)其他唑類抗真菌藥物是否具有增效作用,本實(shí)驗(yàn)選擇咪唑類抗真菌藥物——酮康唑(ketoconazole,KCZ)為對(duì)象,采用棋盤式微量液基稀釋法(簡(jiǎn)稱棋盤法),測(cè)定TET與KCZ聯(lián)合對(duì)16株臨床分離的同一親本來源白念珠菌的體外抗真菌活性,以O(shè)D值測(cè)定法判讀結(jié)果,并以分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)(fractionalinhibitoryconcentrationindex,FICI)法對(duì)聯(lián)合用藥結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1氟康唑藥物敏感試驗(yàn)白念珠菌CA-1～CA-17(不含CA-10;美國(guó)西雅圖生物醫(yī)學(xué)中心White教授惠贈(zèng)),其中CA-1～CA-9,CA-11和CA-12對(duì)氟康唑敏感(MIC≤8.0μg/mL),CA-13～CA-15對(duì)氟康唑劑量依賴性敏感(16μg/mL≤MIC≤32μg/mL),CA-16和CA-17對(duì)氟康唑耐藥(MIC≥64.0μg/mL)。該系列菌株來自于同一HIV感染者,并已證實(shí)其來源于同一親本。質(zhì)控菌株為美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的克柔念珠菌ATCC6258和近平滑念珠菌ATCC22019。1.1.2甲基亞dmsoKCZ(西安楊森制藥有限公司,純度>98.5%),TET(陜西慧科植物有限公司,批號(hào)20041226,純度98%),二甲基亞砜(DMSO,美國(guó)Sigma公司)。沙堡弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司),RPMI-1640液體培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司,pH7.0)。酶標(biāo)儀(680型,美國(guó)BIO-RAD公司),96孔板(美國(guó)Costar公司)。1.2方法1.2.1細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)將受試菌株于SDA中35℃轉(zhuǎn)種2次,挑取單個(gè)較大菌落用0.9%生理鹽水配制菌懸液,以中國(guó)細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)濁度管比濁。以RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整菌液濃度,使96孔板內(nèi)菌液工作濃度為(0.5～2.5)×103CFU/mL。1.2.2烏蘇葉/hci標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備KCZ用DMSO溶解,配制成5120μg/mL的儲(chǔ)備液;TET用滅菌雙蒸水和0.1mol/LHCI溶解,配制成濃度為5120μg/mL的儲(chǔ)備液(其中,0.1mol/LHCI的終濃度<0.005mol/L,預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)它對(duì)白念珠菌無(wú)毒性)。兩種藥物儲(chǔ)備液分別過濾分裝后,-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.3mic值的測(cè)定根據(jù)CLSIM27-A3酵母菌液基微量稀釋法進(jìn)行測(cè)定。用RPMI-1640液體培養(yǎng)基將藥物儲(chǔ)備液稀釋至2倍工作濃度。取其100μL倍比稀釋后依次加入96孔板的第2～11列;第1列為生長(zhǎng)對(duì)照,不加藥液,而以100μLRPMI-1640液體培養(yǎng)基代替;第12列為空白對(duì)照,加入200μLRPMI-1640液體培養(yǎng)基。除第12列外,其余各孔再分別加入100μL菌懸液至工作濃度。上述體系中DMSO含量均不高于1%,對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響忽略不計(jì)。將制備好的96孔板置35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,用酶標(biāo)儀測(cè)定OD490值,從而確定MIC值。OD值測(cè)定法:用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490nm處讀取96孔板中各孔的OD值。以如下公式計(jì)算:真菌生長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)=(各孔OD值—空白對(duì)照孔OD值)/(生長(zhǎng)對(duì)照孔OD值—空白對(duì)照孔OD值)×100%。真菌生長(zhǎng)抑制百分?jǐn)?shù)=1-真菌生長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)。取與生長(zhǎng)對(duì)照相比較抑制80%以上真菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。1.2.4kcz-97孔板的制備參照CLSIM27-A3方案,以棋盤法測(cè)定TET與KCZ聯(lián)合對(duì)上述16株白念珠菌的體外抗真菌活性。通過上述實(shí)驗(yàn)確定TET與KCZ的適當(dāng)濃度范圍。以RPMI-1640液體培養(yǎng)基分別將兩種藥物儲(chǔ)備液稀釋至4倍工作濃度(終濃度范圍分別是:TET1-64μg/mL,KCZ0.008-8μg/mL)。按照濃度從低到高的順序,取倍比稀釋的KCZ藥液50μL分別加入96孔板的第2～12列;按照濃度從高到低的順序,取倍比稀釋的TET藥液50μL,分別加入96孔板的第A～G行。除A12孔之外,其余各孔再分別加入菌懸液100μL。不足200μL液體的孔用RPMI-1640液體培養(yǎng)基補(bǔ)足。其中,H1孔為不含藥液的生長(zhǎng)對(duì)照,A12孔為不含菌液的空白對(duì)照。將制備好的96孔板置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,以O(shè)D值測(cè)定法判讀結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。1.2.5la理論基礎(chǔ)在評(píng)價(jià)藥物體外聯(lián)合作用的結(jié)果和強(qiáng)度時(shí),有多種不同的理論模型。在眾多的數(shù)據(jù)處理方法中,Loeweadditivity(LA)理論是應(yīng)用最為普遍的一種數(shù)據(jù)處理模型,該理論的基礎(chǔ)是某種藥物不可能和它本身發(fā)生作用?；谶@一理論的模型是將藥物單用和聯(lián)用時(shí)產(chǎn)生相同藥效的濃度進(jìn)行比較。本實(shí)驗(yàn)采用的FICI法就是以LA理論為基礎(chǔ)的非參數(shù)模型。其公式為∑FIC=FICA+FICB=MICAB/MICA+MICBA/MICB,式中的MICA和MICB分別表示藥物A和B單用時(shí)的MIC值,MICAB和MICBA分別表示兩種藥物聯(lián)用時(shí)各自的MIC值。對(duì)于同一96孔板,通過計(jì)算所得的一組∑FIC值,當(dāng)∑FICmax>4時(shí),則FICI定義為∑FICmax;否則,FICI定義為∑FICmin。結(jié)果的判斷依據(jù)是:FICI≤0.5為協(xié)同作用,FICI>4為拮抗作用,0.5<FICI≤4為無(wú)關(guān)作用。2tet與kcz聯(lián)用時(shí)的mic值本實(shí)驗(yàn)測(cè)得質(zhì)控菌株克柔念珠菌ATCC6258和近平滑念珠菌ATCC22019對(duì)KCZ的MIC值分別為0.25～0.5μg/mL和0.125～0.5μg/mL,均在規(guī)定的參考范圍內(nèi),且生長(zhǎng)對(duì)照孔生長(zhǎng)良好,說明本實(shí)驗(yàn)操作與結(jié)果符合CLSI要求。TET與KCZ單獨(dú)或聯(lián)合作用于實(shí)驗(yàn)所用16株白念珠菌的MIC值見表1。以KCZ的MIC≤0.125μg/mL為敏感(S),≥1μg/mL為耐藥(R),0.25～0.5μg/mL為劑量依賴性敏感(SDD)的判斷標(biāo)準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)所用16株白念珠菌均為KCZ耐藥株,MIC值為1～32μg/mL。TET對(duì)這16株白念珠菌的作用極弱,MIC值為64～128μg/mL,且無(wú)菌株差異性。TET與KCZ聯(lián)用時(shí),兩藥MIC值均明顯降低,分別為2～16μg/mL和0.016～0.5μg/mL,且終點(diǎn)清晰,“拖尾現(xiàn)象”消失,說明TET可明顯增強(qiáng)KCZ的敏感性。用FICI法評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,如表2所示,16株白念珠菌的FICI值為0.033～0.133(均小于0.5),說明TET與KCZ聯(lián)合使用時(shí)表現(xiàn)為協(xié)同作用。3tet與kcz的增效作用KCZ是治療白念珠菌病的常用藥物,但隨著其廣泛、長(zhǎng)期應(yīng)用,白念珠菌耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重,給臨床治療帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。除了積極探索和開發(fā)新型抗真菌藥物以外,聯(lián)合用藥不失為有效捷徑?？拐婢委煹穆?lián)合用藥可采用兩種以上結(jié)構(gòu)不同的抗真菌藥物,或選用本身無(wú)抗真菌活性的藥物作為抗真菌藥物增效劑,以增加真菌的敏感性。我們前期研究已經(jīng)證實(shí),TET在體內(nèi)、外可增強(qiáng)氟康唑等的抗白念珠菌活性,其增效機(jī)制與抑制外排泵基因MDR1、FLU1、CDR1、CDR2的表達(dá)有關(guān)。為了探討TET在體外對(duì)KCZ是否有增效作用,本實(shí)驗(yàn)使用棋盤法和FICI法測(cè)定并評(píng)價(jià)了TET與KCZ在體外聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的抗真菌活性。本實(shí)驗(yàn)采用的棋盤法和FICI法是目前國(guó)際上測(cè)定并評(píng)價(jià)藥物體外聯(lián)合作用效果時(shí)使用最廣泛、最能被公認(rèn)的方法,操作簡(jiǎn)便,重復(fù)性好,結(jié)果明確,已被應(yīng)用于抗真菌藥物體外聯(lián)合作用的測(cè)定評(píng)價(jià)。目前液基稀釋法中MIC值的判讀多用視覺法,但其受主觀因素影響較大且不能定量地記錄結(jié)果,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏準(zhǔn)確性和客觀性。本實(shí)驗(yàn)以酶標(biāo)儀測(cè)定OD值的方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀,通過透光率來反映真菌的生長(zhǎng)情況,具有客觀、定量、迅速、簡(jiǎn)便及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。TET來源于天然藥用植物,作用溫和、來源廣泛、價(jià)格低廉,已用于抗高血壓、抗纖維化等治療領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TET在體外單獨(dú)使用時(shí)抗真菌活性極弱;當(dāng)其與KC