地溝油中辣椒堿類化合物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測

地溝油中辣椒堿類化合物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測

“地溝油”一般指各種頹廢的優(yōu)質(zhì)食用油。主要包括廚房垃圾，以及由動物皮、肉和內(nèi)臟經(jīng)過加工和精制的剩余油。因其來源不同、精煉加工程度不同,不僅食用油中亞油酸、亞麻酸等人體必需的脂肪酸、植物甾醇、生育酚等油脂伴隨物的含量大幅降低,營養(yǎng)價值顯著降低,而且還殘留數(shù)量不等的重金屬、真菌毒素、油脂氧化物等有毒、有害成分,長期或大量食用對人體健康極為有害。導(dǎo)致食用油中摻兌“地溝油”的現(xiàn)象在國內(nèi)長期存在的原因,除了暴利驅(qū)使外,缺乏有效的檢測技術(shù)也是重要原因。目前,對“地溝油”的鑒別檢驗方法已開展了大量的探索性研究工作,取得了一定的成績,研究者開發(fā)、建立了以膽固醇及脂肪酸組成含量分析、電導(dǎo)率檢測、外來污染物的檢測(十二烷基苯磺酸鈉、黃曲霉毒素)等檢測“地溝油”的方法。但現(xiàn)有的各種餐廚廢油脂檢測方法存在特征指標(biāo)專一性不強(qiáng),或檢測靈敏度不高,或檢測準(zhǔn)確性不高的問題;導(dǎo)致所建立的方法僅能在一定范圍內(nèi)適用于特定類型的餐廚廢油脂的檢測判定。辣椒中的辣味成分主要是辣椒堿,利用色譜、核磁共振等方法分析其化學(xué)組分后發(fā)現(xiàn)天然辣椒堿是由14種辣椒素同系物組成,其中辣椒素約占46%~77%,二氫辣椒素約占21%~40%,兩者占90%以上。在各種食用香味調(diào)料中,丁香酚是其香味的主要成分之一。作為基本五味,在一日三餐的菜肴中都會或多或少地加入辣味和香味調(diào)味品。因此辣椒堿類物質(zhì)和丁香酚廣泛地存在于回收的“地溝油”中。據(jù)知情者介紹,社會上早已經(jīng)形成了一個從收購到加工再到銷售“一條龍”式的“地溝油”生產(chǎn)、銷售鏈條。他們一般先將收集的餐廚廢油脂(水、渣、油混合物)加熱、脫渣,制成粗毛油;再通過加熱和脫色(用活性炭、白土等),制成脫色油;脫色油或再經(jīng)過高溫真空脫臭,制成脫臭油。粗毛油以及經(jīng)不同程度精煉加工生產(chǎn)的脫色油和脫臭油都是二次油(reusedoils)。由于使用有機(jī)溶劑進(jìn)行化學(xué)萃取蒸餾提純會大大增加加工成本,所以“地溝油”的精煉加工操作均為物理過程,從而使沸點高、易溶于有機(jī)溶劑的辣椒素和丁香酚在加工過程中難以去除,存留于二次油中,故本實驗選擇上述物質(zhì)作為判定“地溝油”的檢測指標(biāo)。本文應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS),在多反應(yīng)監(jiān)測(multiplereactionmonitoring,MRM)模式下,建立了測定油樣中辣椒堿類化合物(包括辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素)及丁香酚(結(jié)構(gòu)式見圖1)含量的方法。該方法具有較高的定性準(zhǔn)確性和靈敏度,可以以此判定食用油樣品是否摻兌了“地溝油”。1實驗部分1.1水質(zhì)、數(shù)據(jù)處理美國ABI公司API2000液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀;島津LC-20A型高效液相色譜儀;美國Beckman公司AllegraX-22R型冷凍離心機(jī);美國Millipore公司Direct-Q3型純水機(jī);梅特勒公司(上海)AE240電子天平(十萬分之一)。數(shù)據(jù)處理采用Analyst1.4.1分析軟件(ABSciex)。辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒堿和丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品由SIGMA公司提供;LC分析所用甲醇為色譜純級,其他試劑均為分析純級。1.2單標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備分別精確稱取辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素和丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg于10mL容量瓶中,加入甲醇溶解并定容至刻度,得1.0g/L辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素和丁香酚單標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用甲醇稀釋單標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制分別含0.01、0.05、0.1、0.5、1.0μg/L辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素和1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μg/L丁香酚的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。1.3加標(biāo)油溶液配制分別用市售優(yōu)質(zhì)食用油30mL制成含辣椒素、二氫辣椒素和合成辣椒素1.0μg/L、丁香酚100μg/L的加標(biāo)油溶液。在上述加標(biāo)油溶液中加入有機(jī)溶劑10mL,振蕩10min,冷凍離心后分離有機(jī)層,用氮氣吹干后,用甲醇溶解、定容,待LC-MS/MS分析。1.4流動相梯度沖洗色譜柱:SUPELCOSILABZ+PlusdC18柱(150mm×4.6mm,5μm,Sigma-Aldrich公司);檢測辣椒堿類化合物所用流動相:甲醇(A)和0.1%甲酸水(B);檢測丁香酚所用流動相:甲醇(A)和水(B)。流動相梯度洗脫程序:0~3min,20%A~70%A;3~6min,70%A;6~7min,70%A~90%A;7~12min,90%A;12~13min,90%A~20%A;13~23min,20%A(其中前12min完成對目標(biāo)化合物的分析,13~23min完成色譜柱的沖洗及下次分析前的柱平衡)。流速:0.5mL/min;進(jìn)樣量:20μL。1.5質(zhì)譜測定方式采用電噴霧離子源(ESI),在正、負(fù)離子電離模式下選用MRM掃描方式進(jìn)行質(zhì)譜測定;霧化氣流量:15L/min;氣簾氣流量:12L/min;輔助加熱氣:氮氣,流量8L/min;加熱溫度:500℃;噴霧電壓:5000V;其他質(zhì)譜條件見表1。2結(jié)果與討論2.1萃取溶劑的選擇大部分“地溝油”樣品的黏度大,成分復(fù)雜,因此選用液-液萃取方法對油樣品中的辣椒堿類化合物及丁香酚進(jìn)行萃取較為合適。以正己烷、四氫呋喃為萃取溶劑,它們易與油樣品發(fā)生混溶;選用甲醇、乙醇、甲醇-四氫呋喃(1∶1,v/v)混合液為萃取溶劑,經(jīng)適當(dāng)?shù)恼袷幒?采用冷凍離心的方式能夠較好地實現(xiàn)萃取液與油樣品的分離。通過測定油樣中添加標(biāo)準(zhǔn)品的回收率考察不同萃取溶劑的提取效果,發(fā)現(xiàn)甲醇對目標(biāo)物的加標(biāo)回收率最高。故實驗中選擇以甲醇作萃取溶劑對樣品進(jìn)行液-液萃取。2.2lcms方法的建立2.2.1色譜條件的確定分別采用不同的流動相體系考察樣品的分離效果,以保留時間長短、色譜峰的重現(xiàn)性等性能指標(biāo)確定最后的色譜條件。辣椒堿類化合物具有較高的極性,檢測時采用甲醇和0.1%甲酸水流動相體系的分離效果較好;檢測丁香酚時采用甲醇和水流動相體系的分離效果較好。通過試驗確定了1.4節(jié)的流動相體系及梯度洗脫程序。考察了不同色譜柱對辣椒堿類化合物和丁香酚的分離效果。SUPELCOSILABZ+PlusdC18柱(150mm×4.6mm,5μm)的分離效果優(yōu)于WatersAtlantisColumndC18柱(100mm×3.9mm,3μm)、WatersAtlantisColumndC18柱(150mm×3.9mm,5μm)和WatersAtlantisColumnT3柱(150mm×2.1mm,3μm)。2.2.2準(zhǔn)分子離子峰[m+h]+的質(zhì)譜特征實測得到辣椒堿類化合物的[M+H]+(辣椒素為m/z306.4,二氫辣椒素為m/z308.4,合成辣椒素為m/z294.0)和丁香酚的[M-H]-(m/z162.9)。一般來說,對具有酚類結(jié)構(gòu)的化合物常采用負(fù)離子電離模式,但辣椒堿類化合物結(jié)構(gòu)中還具有酰胺基團(tuán),在正離子電離模式下更易形成準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+。辣椒堿類化合物具有相似的分子結(jié)構(gòu),進(jìn)一步裂解也得到相似的裂解產(chǎn)物,尤其是m/z137的碎片離子峰,其為C-N鍵斷裂后形成的香草基部分,是辣椒堿類化合物的特征碎片離子峰。在辣椒堿類化合物的質(zhì)譜分析中均檢測到此離子碎片峰的存在,該離子碎片峰在測定中作為定量離子。辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素分子在失去m/z137的特征離子碎片后,得到不同的子離子碎片(見表1)。由于辣椒堿類化合物具有相似的分子結(jié)構(gòu),因此諸如碰撞能量(CE)等其他測定條件也相似。采用負(fù)離子電離模式檢測丁香酚,在碰撞能量較低時亦能得到準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-。進(jìn)一步裂解時其分子結(jié)構(gòu)中香草基部分的甲氧基C-N鍵發(fā)生斷裂,形成穩(wěn)定的子離子碎片峰m/z148,將其作為定量離子。2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線及關(guān)鍵因素在優(yōu)化的LC-MS/MS條件下測定系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,以信噪比(S/N)≥3確定方法的檢出限(LOD),得到辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素及丁香酚的LOD分別為0.02、0.03、0.03和0.6μg/L。由于所建立的方法對辣椒堿類化合物具有較高的靈敏度,而對丁香酚的靈敏度較低,且檢測辣椒堿類化合物和丁香酚需要采用不同的流動相系統(tǒng)、不同的電離模式,故采用兩次進(jìn)樣分別檢測的方式進(jìn)行測定。在實際的“地溝油”檢測中,以辣椒堿類化合物作為地溝油檢測的主要依據(jù),丁香酚作為參考。由表2可見在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),辣椒堿類化合物及丁香酚均呈良好的線性關(guān)系。圖2為添加目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品油樣的MRM譜圖。2.4回收率、精密度取辣椒堿類化合物及丁香酚的標(biāo)準(zhǔn)液和市售優(yōu)質(zhì)食用油,分別配成0.1、0.5、1.0μg/L的加標(biāo)油溶液,每個水平加標(biāo)油溶液各取3份,由3個不同人員進(jìn)行測定,每個樣品每人重復(fù)測定5次,得到的回收率和同一人員、不同人員間測定的精密度見表3。2.5實際檢測結(jié)果采用本文建立的方法對5份不同品牌的市售優(yōu)質(zhì)食用油進(jìn)行檢測,在各檢材中均未檢出辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素和丁香酚。說明該上述方法的特異性良好。在衛(wèi)生部舉行的“地溝油”檢驗方法考評中,此方法經(jīng)過多輪盲樣驗證考核,無一例誤檢為假陽性,“地溝油”陽性結(jié)果檢出率超過80%,在所有檢測方法中排名靠前。目前,該方