瓜子金有效部位群抗炎作用機制的體外研究

瓜子金有效部位群抗炎作用機制的體外研究

瓜金是科的一種無性系植物，不同于小型遠志、地藤草和銀杏葉。這是科維科。瓜子金最早見載于《植物名實圖考》,曾被1977年版《中國藥典》收載,全草入藥,具有祛痰止咳、寧心安神、散血止瘀的作用,主治咳嗽痰多、咽喉腫痛、心悸失眠、癰腫瘡瘍等癥。河南伏牛山地區(qū)民間用其治療肺結(jié)核、咽喉腫痛、無名癤腫、食道癌、呼吸道炎癥、毒蛇咬傷等疾病,均有良好的療效。研究資料顯示瓜子金體內(nèi)給藥具有顯著的抗炎活性。本試驗室前期研究中采用大孔吸附樹脂純化技術(shù)獲得以總黃酮、總皂苷為主要成分的有效部位群(總黃酮、總皂苷含量達77%以上),本文利用體外炎癥模型對瓜子金有效部位群抗炎機制進行初步的研究。1材料表面1.1母株參數(shù)264。71.2藥物和試劑1.3基因擴增儀器多元定量PCR儀(美國MJRESEARCH公司);多功能熒光酶標儀(瑞士Tecan公司);EDC-810基因擴增儀(東盛創(chuàng)新生物科技有限公司);BS110S分析天平(德國Sartorius公司);Napco5410型二氧化碳孵箱,美國NAPCO公司;BCN-1360型超凈工作臺,北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;XDS-1B倒置顯微鏡,重慶光電儀器公司。2方法2.1家蠶的培養(yǎng)和處理RAW264.7細胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清100U·mL-1青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中,在37℃5%CO2條件下培養(yǎng)。2.2mtt法測瓜子金的存活率RAW264.7細胞按2×105/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24h后,棄上清,分別加入質(zhì)量濃度為100,50,20,10,1mg·L-1的瓜子金有效部位群,每個濃度設(shè)5個復(fù)孔,37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h,每孔加入MTT(5g·L-1,PBS配制)20μL,繼續(xù)孵育4h,棄去上清,每孔加入150μLDMSO,震蕩10min,于492nm波長處測定吸光度(A)。藥物對細胞生長的抑制作用以存活率表示,存活率越高,表明藥物毒性越低。存活率計算公式如下:2.3基于lps的瓜子金形細胞的刺激細胞懸液以每孔1×105/100μL接種于96孔板,培養(yǎng)24h。空白組采用含0.1%DMSO的RMPI1640培養(yǎng)細胞,模型組采用LPS(1mg·L-1)刺激細胞,瓜子金有效部位群組采用10,20,50mg·L-13個劑量處理細胞。各組分別刺激24,48h后,吸取96孔板中的培養(yǎng)液100μL到另一96孔板中,加入等體積的Griessreactin試劑,室溫放置10min,用酶標儀讀取540nm處A,計算瓜子金有效部位群各劑量組在不同處理時間對細胞上清液中亞硝酸鹽抑制率。2.4瓜子金細胞tnf-和il-6含量檢測將RAW264.7細胞隨機分為正常對照組,LPS刺激組和瓜子金有效部位群組,每組設(shè)3個復(fù)孔,正常對照組用RPMI1640完全培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng);LPS刺激組加入LPS使終濃度為1mg·L-1;瓜子金有效部位群組加入藥物使終濃度為50mg·L-1,同時加入終濃度為1mg·L-1的LPS。37℃5%CO2孵育12h,收集上清液,用ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α和IL-6含量。操作步驟按試劑盒說明書進行。2.5pcr檢測cd細胞的培養(yǎng)與分組同2.4。分組后分別加入藥物和LPS刺激2,4,8,12h,收集細胞,加入1mLTrizol裂解,按說明書方法提取總RNA。按總RNA12μL,5×RTBuffer4μL,2.5mmol·L-1dNTP混合液2μL,100U·μL-1RTAce1μL比例配制混合液,混合液在PCR分析儀中按如下程序進行逆轉(zhuǎn)錄:30℃10min,42℃40min,85℃5min,4℃5min,獲得cDNA。按RealtimePCRMasterMix12.5μL,三蒸水11.0μL,引物0.25μL,cDNA模板1.0μL配制Real-timePCR反應(yīng)液,反應(yīng)液置Real-timePCR儀上進行PCR反應(yīng),以GAPDH為內(nèi)參照,根據(jù)C(t)值計算TNF-α和IL-6mRNA的相對表達量。2.6統(tǒng)計處理采用SPSS11.5軟件,統(tǒng)計分析采用方差分析,結(jié)果用表示,P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果3.1兩組患者的致突變性對比結(jié)果表明,瓜子金有效部位群質(zhì)量濃度為100mg·L-1時細胞存活率低于正常對照組,與正常對照組相比有極顯著性差異(P<0.01);藥物質(zhì)量濃度在1~50mg·L-1各給藥組與正常對照組比較,細胞存活率無顯著性差異,說明瓜子金有效部位群在1~50mg·L-1無明顯細胞毒性。3.2瓜金有效異組對細胞中的no生成的影響3.3兩組il-6含量比較如表2所示,空白對照組僅有少量TNF-α和IL-6表達,LPS刺激組TNF-α,IL-6含量明顯增加(P<0.01);瓜子金有效部位群組與LPS刺激組相比,TNF-α和IL-6蛋白的含量明顯減少(P<0.01),說明瓜子金有效部位群可顯著抑制TNF-α和IL-6的表達。3.4瓜子金有效部位的tnf-和il-6mrna的相對表達RAW264.7細胞經(jīng)LPS刺激后,TNF-α和IL-6mRNA的相對表達量在不同的時間點均顯著增加,其中TNF-αmRNA在2h時相對表達量最高,IL-6mRNA在8h時相對表達量最高;與LPS刺激組相比,瓜子金有效部位群組在各時間段TNF-α和IL-6mRNA的相對表達量均明顯降低(P<0.01或P<0.05)。如圖1~2所示。4瓜子金有效部位群的抗炎作用巨噬細胞是炎癥過程的重要效應(yīng)細胞,廣泛參與機體的炎癥反應(yīng),當(dāng)受某些因素激活后會產(chǎn)生大量的NO和TNF-α,并進一步誘導(dǎo)IL-6等炎癥細胞因子的產(chǎn)生。脂多糖(LPS)為炎癥刺激物,可激活巨噬細胞,促使NO、氧自由基、胞因子、趨化因子、細前列腺素等的表達,加劇炎癥反應(yīng)。本試驗針對瓜子金有效部位群對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞釋放NO,TNF-α及IL-6等炎癥因子的影響進行了研究,結(jié)果表明瓜子金有效部位群能顯著抑制NO,TNF-α及IL-6的生成與釋放,能顯著降低TNF-α和IL-6mRNA的表達。由此可以推測瓜子金有效部位群可能通過調(diào)節(jié)巨噬細胞產(chǎn)生NO,TNF-α及IL-6等炎癥因子來發(fā)揮抗炎作用。本試驗室前期研究中已采用現(xiàn)代大孔吸附樹脂純化技術(shù)獲得瓜子金有效部位群(總黃酮、總皂苷含量達77%以上),本研究是在前期研究的基礎(chǔ)上,對瓜子金有效部位群抗炎的作用機制進行探討,以期為其二次開發(fā)出物質(zhì)基礎(chǔ)明確、作用機制清楚的現(xiàn)代中藥制劑提供科學(xué)依據(jù)。購于武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心。瓜子金有效部位群,秋季成熟時采集瓜子金全草,洗凈,曬干,70%乙醇提取,大孔吸附樹脂純化后噴霧干燥,其中總黃酮、總皂苷含量達77%以上(其中總黃酮含量不低于33%,總皂苷含量不低于44%);試驗時用二甲基亞砜及無水乙醇(1∶9)溶解,配成實驗所需濃度。脂多糖(LPS,011B4),Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)基,Invitrogen公司;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司;TrizolReagent,Invitrogen公司;人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白介素-6(IL-6)ELISA試劑盒,美國R&D公司;其余試劑為國產(chǎn)分析純。存活率=(藥物干預(yù)孔A-空白對照孔A)/(正常細胞孔A-空白對照孔A)×100%抑制