高效液相色譜分析技術(shù)-方法認(rèn)證和注意事項(xiàng)課件

高效液相色譜分析技術(shù)—方法認(rèn)證和注意事項(xiàng)1上海市食品藥品檢驗(yàn)所陳桂良藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證的目的證明采用的方法適合于相應(yīng)檢測(cè)要求。在起草藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，分析方法需經(jīng)驗(yàn)證；在藥物生產(chǎn)方法變更、制劑的組分變更、原分析方法進(jìn)行修訂時(shí)，則質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法也需進(jìn)行驗(yàn)證。方法驗(yàn)證過程和結(jié)果均應(yīng)記載在藥品標(biāo)準(zhǔn)起草或修訂說明中。2需驗(yàn)證的分析項(xiàng)目3鑒別試驗(yàn)，雜質(zhì)定量或限度檢查，

原料藥或制劑中有效成分含量測(cè)定，以及制劑中其他成分(如降解產(chǎn)物、防腐劑等)的測(cè)定。藥品溶出度、釋放度等功能檢查中，其溶出量等測(cè)

試方法也應(yīng)作必要驗(yàn)證。典型的驗(yàn)證參數(shù)(Characteristics)4準(zhǔn)確性(Accuracy)精密度(Precision)重復(fù)性(Repeatablity)中間精密度(Intermediate

Precision)專屬性(Specificity)檢測(cè)限度(Detection

limit)定量限度(Quantitation

limit)線性(Linearity)范圍(Range)耐用性(Robustness)5含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度6原料藥可用已知純度的對(duì)照品或樣品進(jìn)行測(cè)定，或用本法所得結(jié)果與已建立準(zhǔn)確度的另一方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。制劑可用含已知量被測(cè)物的各組分混合物進(jìn)行測(cè)定。如不能得到制劑的全部組分，可向制劑中加入已知量的被測(cè)物進(jìn)行測(cè)定，或與另一個(gè)已建立準(zhǔn)確度的方法比較結(jié)果。如該法已建立了精密度、線性和專屬性，準(zhǔn)確度有時(shí)也能推算出來，不必再做。雜質(zhì)定量測(cè)定的準(zhǔn)確度7可向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。如果不能得到雜質(zhì)或降解產(chǎn)物，可用本法測(cè)定結(jié)果與另一成熟的方法進(jìn)行比較，如藥典標(biāo)準(zhǔn)方法或經(jīng)過驗(yàn)證的方法。如不能測(cè)得雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的相對(duì)響應(yīng)因子，則可用原料藥的響應(yīng)因子。應(yīng)明確證明單個(gè)雜質(zhì)和雜質(zhì)總量相當(dāng)于主成分的重量比

(%)，或是面積比(%)。數(shù)據(jù)要求8在規(guī)定范圍內(nèi)，至少用9次測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，例如制備3個(gè)不同濃度的樣品，各測(cè)定3次。應(yīng)報(bào)告已知加入量的回收率(%)，或測(cè)定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其可信限。精密度9精密度系指在規(guī)定的測(cè)試條件下，同一個(gè)均勻樣品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。在相同條件下，由一個(gè)分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性；在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測(cè)定結(jié)果的精密度，稱為中間精密度；在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度，稱為重現(xiàn)性。含量測(cè)定和雜質(zhì)定量測(cè)定應(yīng)考慮方法的精密度。10重復(fù)性11在規(guī)定范圍內(nèi)，至少用9次測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，如制備3個(gè)不同濃度的樣品，各測(cè)定3次，或把被測(cè)物濃度當(dāng)作100%，用至少測(cè)定6次的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。中間精密度12為考察隨機(jī)變動(dòng)因素對(duì)精密度的影響，應(yīng)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行中間精密度試驗(yàn)。變動(dòng)因素為不同日期、不同分析人員、不同設(shè)備。重現(xiàn)性13當(dāng)分析方法將被法定標(biāo)準(zhǔn)采用時(shí)，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)。如建立藥典分析方法時(shí)通過協(xié)同檢驗(yàn)得出重現(xiàn)性結(jié)果，協(xié)同檢驗(yàn)的過程、重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說明中。數(shù)據(jù)要求14均應(yīng)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和可信限(%)。專屬性15專屬性系指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在下，采用的方法能準(zhǔn)確測(cè)定出被測(cè)物的特性。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查、含量測(cè)定方

法，均應(yīng)考察其專屬性。如方法不

夠?qū)?，?yīng)采用多個(gè)方法予以補(bǔ)充。鑒別反應(yīng)16應(yīng)能與可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似化合物區(qū)分。不含被測(cè)成分的樣品，以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，均應(yīng)呈負(fù)反應(yīng)。含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定17色譜法中的分離度應(yīng)符合要求。在雜質(zhì)可獲得的情況下，對(duì)于含量測(cè)定，試樣中可加入雜質(zhì)或輔料，考察測(cè)定結(jié)果是否受干擾，并可與未加雜質(zhì)和輔料的試樣比較測(cè)定結(jié)果。對(duì)于雜質(zhì)測(cè)定，也可向試樣中加入一定量的雜質(zhì)，考察雜質(zhì)能否得到分離。在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可將含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣進(jìn)行

測(cè)定，與另一個(gè)經(jīng)驗(yàn)證了的或藥典方

法比較結(jié)果。用強(qiáng)光照射，高溫，高

濕，酸、堿水解，或氧化的方法進(jìn)行

加速破壞，以研究降解產(chǎn)物。含量測(cè)

定方法應(yīng)比對(duì)二法的結(jié)果，雜質(zhì)測(cè)定

應(yīng)比對(duì)檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)，必要時(shí)可采

用光二極管陣列檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)，進(jìn)

行純度檢查。18檢測(cè)限19非儀器分析目視法(用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量);信噪比法(用于能顯示基線噪音的分析方法，即把已知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，算出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。一般以信噪比為3∶1或2∶1時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測(cè)限)。定量限20定量限系指樣品中被測(cè)物能被定量

測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)具一

定準(zhǔn)確度和精密度。雜質(zhì)和降解產(chǎn)

物用定量測(cè)定方法研究時(shí)，應(yīng)確定

定量限。常用信噪比法確定定量限。一般以信噪比為10∶1時(shí)相應(yīng)的濃度或注入儀器的量進(jìn)行確定。線性21指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果與試樣

中被測(cè)物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系。可

用一貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密

稱樣，制備一系列供試樣品的方法進(jìn)

行測(cè)定，至少制備5份供試樣品。函數(shù)作圖，或用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。響應(yīng)信號(hào)也可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行線性回歸計(jì)算。范圍22范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果和要求確定。原料

藥和制劑含量測(cè)定，范圍應(yīng)為測(cè)試濃度

的80%～120%；制劑含量均勻度檢查，范圍應(yīng)為測(cè)試濃度的70%～130%等；如果含量測(cè)定與雜質(zhì)檢查同時(shí)測(cè)定，用百分歸一化法，則線性范圍應(yīng)為雜質(zhì)規(guī)定限度的-20%至含量限度(或上限)的+20%。耐用性23指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，為常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。開始研究分析方法時(shí)，就應(yīng)考慮其耐用性。如果測(cè)試條件要求苛刻，則應(yīng)在方法中寫明。典型的變動(dòng)因素有：被測(cè)溶液的穩(wěn)定性，樣品提取次數(shù)、時(shí)間等。液相色譜法中典型的變動(dòng)因素有：

流動(dòng)相的組成和pH值，不同廠牌或

不同批號(hào)的同類型色譜柱，柱溫，

流速等。氣相色譜法變動(dòng)因素有：

不同廠牌或批號(hào)的色譜柱、固定相，不同類型的擔(dān)體、柱溫，進(jìn)樣口和

檢測(cè)器溫度等。經(jīng)試驗(yàn)，應(yīng)說明小的變動(dòng)能否通過設(shè)計(jì)的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，以確保方法有效。24用于原料藥中主要組分或制劑中有

效組分含量測(cè)定的方法：除了檢測(cè)

限和定量限二項(xiàng)指標(biāo)外，對(duì)精密度、準(zhǔn)確度、選擇性、線性與范圍、耐

用性等均應(yīng)有所要求25用于原料藥中雜質(zhì)測(cè)定或制劑中降解產(chǎn)物測(cè)定的方法又可分為兩種：①用于含量測(cè)定：②用于限度檢查。對(duì)于①法的要求是：除檢測(cè)限和精密度指標(biāo)不必要求外，對(duì)準(zhǔn)確度、選擇性、線性與范圍、定量限、耐用性等均應(yīng)有所要求；對(duì)于②法的要求是：只對(duì)檢測(cè)限、選擇性和耐用性三項(xiàng)指標(biāo)有所要求，其余均無需要求。26用于溶出度測(cè)定的方法及藥物釋放度測(cè)定的方法，只有精密度和耐用性有所要求，其余項(xiàng)目可不作要求。27用于生物樣品中藥物測(cè)定的方法，對(duì)精密度、準(zhǔn)確度、檢測(cè)限、選

擇性、可測(cè)線形范圍、定量限、

對(duì)生物樣品的耐用性以及與參比

方法測(cè)得結(jié)果的相關(guān)程度的比較

等指標(biāo)應(yīng)有所要求。28說明29①已有重現(xiàn)性驗(yàn)證，不需驗(yàn)證中間精密度。②如一種方法不夠?qū)?，可用其他分析方法予以補(bǔ)充。③有些參數(shù)視具體情況予以驗(yàn)證。HPLC含量測(cè)定方法30專屬性：⑴

系統(tǒng)分辨力；⑵

加速穩(wěn)定性試驗(yàn)；⑶

色譜峰完整性。系統(tǒng)分辨力31色譜系統(tǒng)必須能將分析樣品中各雜質(zhì)與樣品活性成份和賦形劑成份的各個(gè)峰可分開，一般要求

R﹥1.5。加速穩(wěn)定性試驗(yàn)?zāi)康哪苤甘井a(chǎn)品的降解產(chǎn)物是否干擾活性成份測(cè)定，由色譜圖和相關(guān)保留時(shí)間說明之。32色譜峰完整性33分析峰完整性和純度，可以用其

他分析技術(shù)證明，如UV方法等也

可用二極管陣列檢測(cè)器掃描檢定，取峰頂點(diǎn)、中點(diǎn)和底部三處光譜

疊加時(shí)應(yīng)完全重疊。線性與范圍34至少用5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液為一組，濃度范圍從50～150%，響應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)濃度（或進(jìn)樣量）成線性關(guān)系，線性回歸分析其相關(guān)數(shù)應(yīng)大于0.999。精密度(系統(tǒng)精密度和方法精密度）系統(tǒng)精密度：標(biāo)準(zhǔn)液六次重復(fù)進(jìn)樣，測(cè)每次響應(yīng)值（峰面積或峰高),六次響應(yīng)值,一般RSD﹤2%;方法精密度：方法精密度（指日內(nèi)和日間)測(cè)定,一般日內(nèi)RSD﹤3%,日間RSD﹤5%。35準(zhǔn)確度/回收率(模擬處方法和

標(biāo)準(zhǔn)加入法)36模擬處方法:加入已知量藥物到空白賦形劑中，至少用三個(gè)水平（50~150%）濃度溶液。各個(gè)回收率應(yīng)在理論量±3%以內(nèi)，全部回收率平均值應(yīng)在理論量±2%內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)加入法:已知量分析樣品加到幾個(gè)樣品中, 分析樣濃度必須在線性范圍內(nèi),三批樣品制劑, 回收率應(yīng)在理論量在±3%內(nèi),總回收率在±2%內(nèi)。耐用性37⑴ 柱—柱間可變性；⑵

分析液穩(wěn)定性；⑶

實(shí)驗(yàn)室核對(duì)；⑷

其他影響因素。柱—柱間易變性38用同一型號(hào)柱和同一制造商的柱但

批號(hào)不同也應(yīng)重復(fù)專屬性試驗(yàn)，至

少用一個(gè)其他制造商生產(chǎn)的同一類

型柱重復(fù)專屬性試驗(yàn)，然后通過試

驗(yàn)要說明哪個(gè)牌號(hào)的柱是可適用的，哪個(gè)牌號(hào)是不適用。氣相色譜柱可

用相同填料的不同批號(hào)裝第二個(gè)柱

做專屬性進(jìn)行觀察評(píng)價(jià)。分析樣品溶液的穩(wěn)定性39分析樣品在溶劑中穩(wěn)定性。允許溶液放在室溫下一定時(shí)間，然后分析此溶液與新鮮配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液有何不同，其響應(yīng)平均值（以峰高或峰面積）與新配制溶液的響應(yīng)值比較應(yīng)在±2%內(nèi)。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)核對(duì)40系統(tǒng)精密度，方法精密度和專屬性試驗(yàn)必須由另一分析者在另一儀器上可重復(fù)性驗(yàn)證。其他影響因素41實(shí)驗(yàn)條件如避光，pH值或流動(dòng)相組份比，溫度，衍生化反應(yīng)時(shí)間，進(jìn)樣溫度等要進(jìn)行論證評(píng)估。靈敏度42檢測(cè)限和定量限，在儀器設(shè)置在最高靈敏度時(shí)可檢出注入樣品的最小量。最小檢出量通常是指分析樣品量產(chǎn)生的響應(yīng)大于噪聲的2~3倍，靈敏度可用檢出限度或定量限度來表示，檢出限度或定量限度越小，該方法靈敏度越高。衍生化條件參數(shù)測(cè)定43若需要衍生化的樣品，在進(jìn)行HPLC或GC測(cè)定前要測(cè)定合適的反應(yīng)條件的參數(shù)如反應(yīng)溫度、時(shí)間等。系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)44在分析任何樣品之前，需測(cè)定理論板數(shù)（N）、分離度（R）、拖尾因子（T）及用標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定的系統(tǒng)精密度。文件資料匯總45詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)原始記錄，包括柱的選擇度并說明哪幾種牌號(hào)柱可使用。應(yīng)具有代表性色譜圖說明分析樣品可與降解物，不純物或賦形劑分離

開，樣品典型色譜圖也應(yīng)包括在內(nèi)。新認(rèn)證的方法與法定方法或老方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)的結(jié)果。四環(huán)素可的松眼膏含量測(cè)定方法研究46樣品來源

四環(huán)素可的松眼膏：上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為020605。性狀：為淡黃色的油膏儀器與試劑47Agilent 1100液相色譜儀，依利特HYPERSIL

BDS

C18

5μ 300×4.0柱；Mettler

AE 240天平。鹽酸四環(huán)素對(duì)照品、醋酸可的松

、醋酸可的松原料藥，環(huán)己烷、甲醇、乙腈均為色譜純，十二烷基硫酸鈉為分析純。測(cè)定方法48鹽酸四環(huán)素和醋酸可的松照高效液相色譜法（中國(guó)藥典2000年版二部附錄VD）測(cè)定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)49用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.01mol/ml十二烷基硫酸鈉溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5）-乙腈（60：40）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。理論板數(shù)按醋酸可的松峰計(jì)算應(yīng)不低于2500，醋酸可的松峰與鹽酸四環(huán)素峰的分離度應(yīng)不小于3.0。對(duì)照品溶液的制備50取醋酸可的松對(duì)照品適量，精密稱定，加甲

醇溶解并稀釋制成每1ml中約含醋酸可的松

0.5mg的溶液，搖勻，作為貯備溶液A。另取

鹽酸四環(huán)素對(duì)照品適量，精密稱定，加少量

水溶解后，加甲醇稀釋制成每1ml中約含鹽酸四環(huán)素0.5mg的溶液，搖勻，作為貯備溶液B。精密量取上述兩貯備溶液各5ml置25ml量瓶中，混勻，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。測(cè)定法51精密稱取適量（約相當(dāng)于醋酸可的松和鹽酸四環(huán)素各2.5mg），精密加入環(huán)己烷5ml，振搖，使主成分溶解，再精密加入甲醇20ml,搖勻，離心，取上清液作為供試品溶液。分別精密量取供試品溶液與對(duì)照品溶液各20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。52系統(tǒng)適用性試驗(yàn)53醋酸可的松峰的保留時(shí)間（Rt）為8.304分鐘，鹽酸四環(huán)素峰保留時(shí)間

(Rt)為11.354分鐘，理論板數(shù)按醋酸可的松峰計(jì)算為7014，按四環(huán)素峰計(jì)算為4180，二峰間的分離度為

5.5。線性試驗(yàn)54當(dāng)醋酸可的松與鹽酸四環(huán)素分別在濃度為10.0～250.0μg/ml（進(jìn)樣體積20μl）范圍內(nèi)，其峰面積與濃度的線性關(guān)系良好

(r=1.000)醋酸可的松濃度

(μg/ml)醋酸可的松峰面積10.20416.5720.40781.7861.202373.1102.03977.1153.05994.1204.07904.2255.01001455鹽酸四環(huán)素濃度

(μg/ml)鹽酸四環(huán)素峰面積9.990405.4119.98814.6859.942647.899.904403.8149.96675.0199.88983.4249.811191565758系統(tǒng)精密度試驗(yàn)59分別精密量取醋酸可的松與鹽酸四環(huán)素貯備溶液各1.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，以醋酸可的松峰面積與鹽酸四環(huán)素峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。醋酸可的松濃度

(μg/ml)峰面積RSD(%)153.05193.90.62n=660153.05114.8153.05137.0153.05196.5153.05165.5153.05157.2鹽酸四環(huán)素濃度(μg/ml)峰面積RSD(%)149.96776.30.84(n=6)149.96644.0149.96643.8149.96756.6149.96696.7149.96678.361回收率試驗(yàn)62醋酸可的松平均回收率：99.6%，RSD=1.6%(n=9)鹽酸四環(huán)素平均回收率：102.6%RSD=0.5%(n=9)最小檢測(cè)量63以信噪比為3：1計(jì)，測(cè)定醋酸可的松最小檢測(cè)量為7.1

ng，鹽酸四環(huán)素最小檢測(cè)量為13.0ng。樣品測(cè)定64醋酸可的松為標(biāo)示量的105.3%，鹽酸四環(huán)素為標(biāo)示量的96.3%。測(cè)定方法說明65色譜條件的選擇提取方法的選擇注意事項(xiàng)66樣品制備流動(dòng)相制備系統(tǒng)維護(hù)樣品制備67對(duì)于多數(shù)分析，樣品制備可能僅包括溶解已知重量

或體積的樣品，稀釋到合適的分析濃度等。然而，

如果進(jìn)行柱前衍生化，就需要大量的樣品制備工作。柱前衍生化可以提高靈敏度，產(chǎn)生專屬性，或者分

離光學(xué)異構(gòu)體，以及減少或消除其它復(fù)雜昂貴的清

除程序。在生物樣品的清潔過程中，通常使用合適

的固體小柱進(jìn)行固相萃取。固相小柱也可用于提高

痕量被測(cè)物的濃度。這些純化步驟可以通過合適的

管路裝置在分析過程中完成，通常使用六通閥或十

通閥，或者使用計(jì)算機(jī)控制泵和閥。無論如何處理，都必須注意采取合適的樣品進(jìn)樣和制備方式。流動(dòng)相及過濾68流動(dòng)相：有機(jī)相應(yīng)為光學(xué)純或HPLC級(jí)；水必須是新鮮的去離子水；其它試劑分析純或更高。使用前均用相應(yīng)的濾膜濾過（≤0.45μm）濾膜：聚四氟乙