第14章 基因工程與蛋白質(zhì)工程

基因工程與蛋白質(zhì)工程第一節(jié)生物工程概述一、生物工程的概念及研究技術(shù)二、生物工程在現(xiàn)代工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)實踐中的應(yīng)用

一、生物工程的概念及研究技術(shù)1．基因工程―在分子水平的遺傳操作技術(shù)

基因工程是生物工程的主體和核心。它是指對不同生物的遺傳物質(zhì)（基因），在體外人工“剪切”、“組合”和“拼接”，使遺傳物質(zhì)重新組合，然后通過載體（微生物質(zhì)粒、噬菌體、病毒），轉(zhuǎn)人微生物或高等生物細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行無性繁殖(稱為克隆，clone)，并使所需要的基因（稱為目的基因）在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的新產(chǎn)品，或創(chuàng)建新的生物類型?；蚬こ瘫逡婕癉NA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，是在分子水平上的一種操作技術(shù)，所以它是分子水平的生物工程。轉(zhuǎn)基因動植物就是利用重組DNA技術(shù)，將動物植物或微生物中經(jīng)過鑒定和分離的特定基因，經(jīng)過精心設(shè)計后轉(zhuǎn)移到動植物體內(nèi)，實現(xiàn)定向改造而獲得新品種或產(chǎn)生新的生物功能。一、生物工程的概念及研究技術(shù)2．細(xì)胞工程―遺傳物質(zhì)在細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移

細(xì)胞工程（cellengineering）是在細(xì)胞水平和亞細(xì)胞水平的生物工程。包括細(xì)胞融合、核移植、細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)和細(xì)胞克隆技術(shù)。細(xì)胞融合是不同種類的細(xì)胞，通過生物學(xué)、化學(xué)或物理學(xué)方法，使其原生質(zhì)體融合在一起，這可以克服遠(yuǎn)緣種間的不親和性，擴(kuò)大遺傳重組范圍，篩選雜種后代；細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，是以工業(yè)生產(chǎn)為目的，不受氣候、季節(jié)等限制，從大量培養(yǎng)的細(xì)胞中獲得藥物和其他有用物質(zhì)；組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，是利用動植物組織和細(xì)胞的全能性，進(jìn)行快速的無性繁殖，在比天然生長發(fā)育短得多的時間內(nèi)得到動植物幼苗或組織，便于工業(yè)化生產(chǎn)。此外，還有通過顯微或超微技術(shù)，將一種細(xì)胞的細(xì)胞核或某種細(xì)胞器轉(zhuǎn)移到另一種不同細(xì)胞中的核移植和細(xì)胞質(zhì)移植技術(shù)，可以產(chǎn)生具有超級功能的新細(xì)胞。一、生物工程的概念及研究技術(shù)3．酶工程―酶的改造與設(shè)計

酶工程（enzymeengineering）包括酶的開發(fā)與生產(chǎn)、酶的固定化和酶的分子改造與新酶研制等技術(shù)。在工業(yè)生產(chǎn)上，就是在一定的生物反應(yīng)器中，利用酶的催化作用，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所需的產(chǎn)品。酶的固定化技術(shù)，就是將酶（或細(xì)胞）與高分子化合物相結(jié)合，成為固相，便于長期反復(fù)使用進(jìn)行連續(xù)化生產(chǎn)。這樣，既保證了酶的特異催化作用，又延長了酶的使用壽命；酶的分子改造和化學(xué)修飾技術(shù)，是通過對酶分子主鏈的“切割”、“剪接”和側(cè)鏈基團(tuán)的修飾，以改變酶的物化性質(zhì)（如提高穩(wěn)定性）及生物活性（如提高酶活力、解除抗原性等），或者給酶賦予新的功能，大大提高酶的實用性；此外，根據(jù)對酶結(jié)構(gòu)的研究以及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的闡明，按照人們的要求設(shè)計新的酶，也是酶工程的重要內(nèi)容及研究方向，在更高層次上擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍。一、生物工程的概念及研究技術(shù)4．生化工程（發(fā)酵工程）―生物工程產(chǎn)品的最終取得手段

生化工程（biochemistryengineering）包括生物反應(yīng)器的設(shè)計、傳感器的研制和產(chǎn)品的分離、精制技術(shù)。生物反應(yīng)器是生物技術(shù)開發(fā)中的一個關(guān)鍵設(shè)備，它為微生物、活細(xì)胞或酶提供良好的環(huán)境，以使細(xì)胞增殖和產(chǎn)品積累。反應(yīng)器系統(tǒng)的設(shè)計應(yīng)逐步實現(xiàn)自動化的程序控制，具有良好的能量和反應(yīng)傳遞性能，并適宜于細(xì)胞的大量增殖，或在產(chǎn)品的分離、精制中必須具有高純度、高回收率的特點。這種反應(yīng)體系如果用于微生物發(fā)酵，即是發(fā)酵工程(fermetengineering),它不同于傳統(tǒng)的發(fā)酵技術(shù)。發(fā)酵工程是將傳統(tǒng)的發(fā)酵與DNA重組、細(xì)胞融合等新技術(shù)相結(jié)合并加以發(fā)展的現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)，所使用的生產(chǎn)菌種應(yīng)是通過生物工程手段選育、改造，并具有新的生物機(jī)能的所謂“工程菌”，因此，所得到的產(chǎn)品無論產(chǎn)量和質(zhì)量都是傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)不能比擬的。二、生物工程在現(xiàn)代工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)實踐中的應(yīng)用1．化工及冶金工業(yè)2．輕工和食品工業(yè)3．醫(yī)藥和醫(yī)藥工業(yè)4．農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)5．環(huán)保和能源工業(yè)

1．化工及冶金工業(yè)生物工程在化學(xué)工業(yè)方面的應(yīng)用越來越廣，隨著生物工程技術(shù)的進(jìn)步，在這方面的應(yīng)用前景十分廣闊。它不僅可提供大量廉價的原料和產(chǎn)品，而且不斷出現(xiàn)省能耗、少污染的新工藝，甚至給整個現(xiàn)代化工業(yè)帶來革新。2．輕工和食品工業(yè)用生物工程技術(shù)改造傳統(tǒng)食品工業(yè)，不僅可大為提高產(chǎn)量，改善質(zhì)量，增進(jìn)效益，而且可開發(fā)新產(chǎn)品，改善人們的膳食結(jié)構(gòu)。目前在這方面主要包括氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)、酶制劑的開發(fā)利用、新糖原的開發(fā)、酒類釀造新工藝以及新型食品添加劑的研制等。3．醫(yī)藥和醫(yī)藥工業(yè)生物工程在醫(yī)學(xué)研究、疾病的診斷和治療、藥物研究和新藥開發(fā)方面是最活躍的領(lǐng)域，進(jìn)展也十分迅速?，F(xiàn)在，完全可以做到直接從基囚人手，在活體內(nèi)從RNA、蛋白質(zhì)、組織細(xì)胞以及生理或形態(tài)表型的水平上進(jìn)行綜合分析，了解許多疾病的發(fā)生機(jī)制。例如，美國科學(xué)家通過轉(zhuǎn)基因動物模型研究纖溶酶原基因發(fā)現(xiàn)，該基因產(chǎn)物具有蛋白質(zhì)溶解作用，當(dāng)這個基因被剔除后，轉(zhuǎn)基因小鼠便發(fā)現(xiàn)廣泛的組織器官損害以及外科手術(shù)后的傷口愈合能力降低，而且進(jìn)一步推測這個基因可能還與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、動脈粥樣硬化、纖維性肺病、細(xì)菌感染等疾病或性狀緊密相關(guān)。4．農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)農(nóng)業(yè)與人類的生活更為密切，現(xiàn)在各個國家都把生物工程在農(nóng)業(yè)上的開發(fā)應(yīng)用列為重點，促使農(nóng)業(yè)真正向現(xiàn)代化方向發(fā)展。采用生物工程技術(shù)，在細(xì)胞和分子水平上研究和改造作物，將導(dǎo)致場新的“綠色革命”。

5．環(huán)保和能源工業(yè)生物工程產(chǎn)業(yè)除本身都是少污染工業(yè)外，還可用于環(huán)境治理，化害為利，不僅減少劉人類的危害，而且可增進(jìn)經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

生物工程在環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域目前主要是在兩個方面：一是利用生物反應(yīng)器來連續(xù)處理工業(yè)廢水或含毒廢液；二是利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建“超級菌”，以處理大面積的污染，如海洋石油污染。在處理廢水方面，可利用一些特殊微生物或藻類，一方面可使污水凈化，另一方面還可以回收金屬等有用物質(zhì)。現(xiàn)在有一種生物技術(shù)，利用細(xì)菌一藻類聯(lián)合系統(tǒng)處理污水，細(xì)菌使水中的有機(jī)物分解，產(chǎn)生二氧化碳、氨和水。藻類則利用太陽能和水中的二氧化碳合成供藻類生長的有機(jī)物，同時產(chǎn)生大量藻類蛋白，并放出氧。所以通過這一系統(tǒng)的循環(huán)過程，既凈化了污水，保護(hù)了環(huán)境，又獲得了大量藻類蛋白，可作為高級飼料用于家禽及漁業(yè)，還可作為高級有機(jī)肥料用于園藝果蔬栽培等。第二節(jié)基因工程一、目的基因的獲得二、基因載體三、重組DNA的篩選及表達(dá)一、目的基因的獲得1．限制酶―特異切割DNA的手術(shù)刀2．取得目的基因的方法―分離法及合成法1．限制酶―特異切割DNA的手術(shù)刀限制酶（restrictionenzyme）是限制性內(nèi)切核酸酶的簡稱，是一類水解DNA的磷酸二醋酶。與以往發(fā)現(xiàn)的一些DNA水解酶相比，限制酶在堿基專一性及斷裂DNA鏈的方式上都有一些特殊的性質(zhì)。限制酶作用于雙鏈DNA，能夠識別DNA分子上特異核營酸序列，造成雙鏈切口，產(chǎn)生獨(dú)特的DNA片段。由于它具有可控制、可預(yù)測的位點特異切割DNA的性質(zhì)，從而成為在分子水平上解剖、繪制基因圖譜、序列分析、克隆以及重新構(gòu)建遺傳信息的極其重要的工具。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的限制酶都來源于原核生物。

2．取得目的基因的方法―分離法及合成法(1)DNA片段的直接提取用于基因工程的DNA分子經(jīng)過限制酶處理后，切成大小不等的片段，從這些片段中分離出所需要的帶有目的基因的片段，可采用一般制備DNA的方法，如凝膠過濾、離子交換或纖維素色譜法以及密度梯度離心等。用這種方法提取的DNA片段，其大小變化較大，在提取過程中也有被破壞的危險。由于全部DNA片段都被提取，必須經(jīng)過大量篩選工作方能得到目的基因，因此盲目性大。但由于此法簡單，并不需要繁雜的操作技術(shù)，故也常采用。

(2)用噬菌體（phage）或質(zhì)粒（plasmid）直接從宿主細(xì)胞中將目的基因攜出有些噬菌體能在宿卞染色體的特定位置插入，在它離開染色體時，可將與之連鎖的基因一起帶出。有些噬菌體在比較廣泛的位置插人，則可帶出更多的基因。例如，大腸桿菌乳糖操縱子的制各，曾采用兩種特定的噬菌休，它們所攜帶的乳糖操縱子方向相反（一個噬菌休接于調(diào)節(jié)基因一邊，另一個接于結(jié)構(gòu)基因一邊），當(dāng)將來自二噬菌體帶有正反基因的兩條單鏈（將其變性后得到）進(jìn)行退火時，操縱子部分可以重新形成雙鏈，而其他部分仍然是松散的單鏈，再用單鏈核酸酶將單鏈部分切除后，留下的即是乳糖操縱了部分。(3)使用相應(yīng)的mRNA分離基因利用酶法或化學(xué)法人上合成的mRNA，或使用從細(xì)胞中提取的mRNA，通過反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）的作用，即可合成相應(yīng)的染色體DNA基因（稱為CDNA）片段；或者用人工合成的mRNA作探釗，去“尋找”與之相應(yīng)的染色體基因。二、基因載體1．質(zhì)粒―染色體以外的遺傳單元2．噬菌體―感染細(xì)菌的病毒1．質(zhì)粒―染色體以外的遺傳單元質(zhì)粒（plasmid）是細(xì)菌染色體以外的能夠進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制的遺傳單元，為雙鏈環(huán)狀DNA。它們的復(fù)制有的受染色體復(fù)制的嚴(yán)格控制。稱為嚴(yán)謹(jǐn)型控制質(zhì)粒(stlingentcontrolplasmid)；有的自行復(fù)制時并不受染色體復(fù)制的嚴(yán)格控制，稱為松弛型控制質(zhì)粒（relaxedcontrolplasmid）?；蚬こ讨谐Ｓ煤笠活愘|(zhì)粒作為載體。質(zhì)粒在細(xì)菌內(nèi)所表達(dá)的性狀，有耐藥性、決定性性狀、產(chǎn)抗生素、產(chǎn)溶血素、產(chǎn)毒素、產(chǎn)細(xì)菌素、抗金屬離子、分解芳香族化合物等，選作基因載體時，選那些表型性狀清楚、容易鑒別的質(zhì)粒。常用的載體選擇具耐藥性和產(chǎn)生細(xì)菌素的質(zhì)粒或?qū)⑵涓脑旌蟮难苌|(zhì)粒，如pSC101、ColEl、pMB9、pBR322等。圖14-1pBR322質(zhì)粒2．噬菌體―感染細(xì)菌的病毒以噬菌體（phage）或病毒（virus）作為載體，將所需基因或含有此基因的DNA片段轉(zhuǎn)移給受體細(xì)胞的過程，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduce）。病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用常常用于基因工程。在基因工程中常用作載體的噬菌體有入噬菌體及其衍生物、柯斯質(zhì)粒（cosmid）及M13單鏈?zhǔn)删w等，以及感染真核生物的病毒SV40等。

噬菌體是感染細(xì)菌的病毒。噬菌體對細(xì)菌的感染有兩種不同方式：種稱為裂解；另種稱為溶原。三、重組DNA的篩選及表達(dá)1．轉(zhuǎn)化―帶有目的基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞2．篩選―從大量受體細(xì)胞中選出帶有重組體的細(xì)胞3．表達(dá)―外源DNA在受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯圖14-2DNA重組體的構(gòu)建步驟1．轉(zhuǎn)化―帶有目的基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞獲得目的基因后，首先應(yīng)將它與基因載體DNA連接，形成重組體。其連接的方法有幾種不同情況。用同一種限制酶處理供體細(xì)胞的染色體和基囚載體，其切口處如果是黏性末端，則帶有目的基因的DNA片段可以同載體的切口“粘接”起來，再通過DNA連接酶連接，形成重組體；如果切口處形成的是平端，DNA連接酶也可連接，但效率很低（只有黏性末端的1%）；或者用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化，分別在載體切口和外源DNA片段一條鏈的3‘一OH末端添加寡聚T（或寡聚C），在另一鏈的3’一OH末端添加寡聚A（或寡聚G），這樣用人為的方法形成黏性末端，便于形成重組體。

2．篩選―從大量受體細(xì)胞中選出帶有重組體的細(xì)胞(1)插入失活法在現(xiàn)在的基因下程操作中，所使用的載體通常都是經(jīng)過加工改造的衍生載體，它們要么帶有一個或幾個可供選擇的遺傳標(biāo)記，要么具有被選擇的遺傳功能。例如，質(zhì)粒載體具有抗藥性或營養(yǎng)標(biāo)記，噬菌體載體形成噬菌斑的能力或特征有所變化。這就使帶有目的基因與不帶口的基因的細(xì)菌有明顯區(qū)別，便于篩選。

(2)放射性探針檢測法利用mRNA可與相應(yīng)的DNA段落雜交，來檢測有外源DNA插入的重組體。是一種快速而靈敏的方法。有兩種雜交法：一是利用放射性RNA作探針；二是形成R一環(huán)。放射性探針檢測法是將轉(zhuǎn)化菌鋪放在瓊脂平板表面的硝酸纖維素膜上，再進(jìn)行培養(yǎng)。然后取出長有菌落的硝酸纖維素膜，用堿溶液處理，使菌落破裂，并使DNA變性。因為變性DNA同硝酸纖維素膜有很強(qiáng)的親和力，便留在膜上，在80℃下烘烤膜，DNA就牢固地固定在膜上。再用放射性同位素標(biāo)記的RNA（或DNA）同膜上的菌落雜交。經(jīng)過一段時間后，用含有一定離子強(qiáng)度的溶液將非專一性結(jié)合的、僅僅是吸附在膜上的放射性物質(zhì)洗去，烘干膜，進(jìn)行放射自顯影。凡是含有與放射性探針互補(bǔ)序列的菌落，就會在X光膠片上出現(xiàn)曝光點，即代表雜交上的菌落（圖14-3）。再按底片上菌落的位置找出培養(yǎng)基上相應(yīng)的菌落。如果需要，將它擴(kuò)大培養(yǎng)后，再作進(jìn)一步分析。

圖14-3放射性探針檢測法篩選DNA重組體(3)R一環(huán)檢測法RNA通過取代與它序列一致的DNA鏈，同相應(yīng)的另一條DNA雜交，被取代的DNA鏈與雜交雙鏈RNA一DNA可形成一個突環(huán)（泡狀），稱為R一環(huán)。形成R一環(huán)的條件是高濃度（70%）的甲酞胺溶液和接近DNA變性的溫度。在這種條件下，將RNA及DNA的混合物退火，RNA便同雙鏈DNA分子中與它互補(bǔ)的序列退火而形成DNA一RNA雜交分子，因為DNA一RNA雜交分子比DNA一DNA分子更穩(wěn)定，所以被取代的另一DNA鏈就被排斥而呈單鏈狀態(tài)。此方法用于篩選重組體時，在有利于形成R一環(huán)的條件下，使待檢測的純化的質(zhì)粒DNA，在含有mRNA的緩沖液中局部變性。如果質(zhì)粒DNA存在著與mRNA探針互補(bǔ)的序列，mRNA就會取代DNA中一條鏈，而與另一鏈形成雙鏈雜交分子，從而形成R一環(huán)結(jié)構(gòu)。然后在電子顯微鏡下觀察，可直接觀察到R一環(huán)。這樣便可檢出重組體質(zhì)粒DNA。(4)免疫測定法只要一個克隆的目的基因，能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)，合成出外源蛋白質(zhì)，就可用免疫測定進(jìn)行檢測。免疫測定法分為放射性抗休測定法和免疫沉淀測定法。放射性抗體測定法是將在固體培養(yǎng)基上由菌落所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再用相應(yīng)的帶有放射性標(biāo)記（如125Ⅰ）的抗體進(jìn)行反應(yīng)，洗去非特異性吸附的放射性物質(zhì)后，用放射自顯影顯示結(jié)果。免疫沉淀測定法是用一種特異抗體與外源基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)，在固體培養(yǎng)基上發(fā)生抗休抗原沉淀反應(yīng)，根據(jù)沉淀物所產(chǎn)生的白色沉淀圈來加以檢測。3．表達(dá)―外源DNA在受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯帶有目的基因的載體轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞成功并篩選出來后，最終目的是要目的基因在受體細(xì)胞中得以表達(dá)，產(chǎn)生具有功能性的蛋白質(zhì)或膚。因為基因表達(dá)是在一定調(diào)節(jié)控制下進(jìn)行的，外源基因在受體細(xì)胞中要能表達(dá)，必須滿足一定的條件。特別是真核基因在細(xì)菌中的表達(dá)。比如，真核基因表達(dá)的啟動子能不能被原核細(xì)胞RNA聚合酶識別而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；真核基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA是否具有核糖體結(jié)合位點，使翻譯能順利進(jìn)行；翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)能否通過細(xì)胞膜而排出細(xì)胞；外源蛋白是否會被受體細(xì)胞中的蛋白酶降解而失活?？傊?，基因工程要達(dá)到最后目的取得功能蛋白，必須依賴于目的基因的有效轉(zhuǎn)錄和mRNA正確的翻譯及翻譯后加工，如果這些環(huán)節(jié)中任何一個環(huán)節(jié)不能正確地進(jìn)行，均可導(dǎo)致基因上程的失敗。第三節(jié)蛋白質(zhì)工程一、蛋白質(zhì)工程的概念二、蛋白質(zhì)工程的一般技術(shù)三、蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用一、蛋白質(zhì)工程的概念1．基因定點突變―定做新蛋白質(zhì)2．蛋白質(zhì)設(shè)計―對天然蛋白質(zhì)的修飾

1．基因定點突變―定做新蛋白質(zhì)這是根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究，設(shè)計一個新蛋白質(zhì)的氨基酸序列，通過修飾編碼原蛋白質(zhì)的DNA序列，最后創(chuàng)造出新的蛋白質(zhì)的技術(shù)。人們長期以來一直希望制造出比天然蛋白質(zhì)性能更好的新的蛋白質(zhì)。曾經(jīng)采用多膚合成的方法從頭合成蛋白質(zhì)，但其局限性很大。雖然有幾個成功的例了，但要合成更大的蛋白質(zhì)是很難實現(xiàn)的，而人工合成的蛋白質(zhì)并不一定能夠折疊成天然蛋白質(zhì)的構(gòu)象。因此，受基因工程的啟發(fā)，解決合成新蛋白質(zhì)的捷徑還得從DNA分子水平入手。根據(jù)新設(shè)計的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，使DNA在體外發(fā)生突變與重組，形成新的基因，然后利用基因工程技術(shù)，得到所需的蛋白質(zhì)。這種對天然存在的結(jié)構(gòu)進(jìn)行有針對性的突變而產(chǎn)生有活性產(chǎn)物的過程，叫寡核背酸誘導(dǎo)的定點突變，簡稱定點突變（sitedirectedmutagenesis）?？梢?/p>