綜合實訓(xùn)4革蘭陰性需氧和兼性需氧桿菌

革蘭陰性需氧和兼性厭氧桿菌xiaobinxuer@163.com革蘭陰性需氧和兼性厭氧桿菌

革蘭陰性桿菌O-F試驗F－o/－非發(fā)酵菌氧化酶試驗+弧菌科腸桿菌科革蘭陰性菌初步分群乳糖發(fā)酵試驗A腸桿菌科共同特性1、相似的形態(tài)染色中等大小，G–桿菌，無芽胞，多數(shù)有動力2、簡單的培養(yǎng)條件3、活潑的生化反應(yīng)初步鑒別腸道致病菌和腸道非致病菌腸道致病菌腸道非致病菌不發(fā)酵乳糖發(fā)酵乳糖A腸桿菌科的鑒別1、形態(tài)觀察（革蘭染色）G–桿菌2、菌落觀察（1）埃希菌在腸道選擇性培養(yǎng)基上發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，在SS和MAC平板上為紅色或粉紅色菌落(2)志賀菌屬：將本菌接種在SS和MAC平板上經(jīng)35℃孵育18～24h。由于志賀菌不分解乳糖，宋內(nèi)志賀菌某些菌株可遲緩發(fā)酵乳糖，故其在SS平板和MAC平板上形成無色透明的、中等大小的菌落。除宋內(nèi)志賀菌菌落外均為光滑型菌落。

(3)沙門菌屬：將本菌接種在SS、MAC平板上經(jīng)35℃孵育18～24h。由于本菌不分解乳糖并產(chǎn)堿，故在SS和MAC平板上形成無色、半透明、光滑濕潤、凸起的小菌落，產(chǎn)生H2S的菌落可在SS平板上形成中心帶黑褐色的小菌落。3、生化反應(yīng)4、血清學(xué)實驗

革蘭陰性桿菌，有周身鞭毛。發(fā)酵多種糖類，多數(shù)能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣

IMViC試驗為++--，MIU:++-,

KIA:AA+-不產(chǎn)H2S大腸桿菌血清型以O(shè)：K：HA1埃希菌能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖,除宋內(nèi)志賀菌IMViC試驗為-+--，MIU:---,KIA:KA--,不產(chǎn)H2S是人類細(xì)菌性痢疾最為常見的病原菌，通稱痢疾桿菌dysenterybacteria無鞭毛，有菌毛生化反應(yīng)形態(tài)A2志賀菌低于其他腸道桿菌，對酸敏感對理化因素的抵抗力血清學(xué)：根據(jù)生化反應(yīng)特征和O抗原分為4群肝脾-腫大膽囊-腸道-排菌(2周）腎臟-尿-排菌（3周)A3傷寒、副傷寒的致病過程傷寒沙門菌和甲型副傷寒桿菌、肖氏沙門菌、希氏沙門菌腸粘膜上皮細(xì)胞腸系膜淋巴結(jié)

固有層淋巴結(jié)進入血液再次進入血液第一次菌血癥發(fā)熱,不適,全身疼痛第二次菌血癥（1周）高熱、外周白細(xì)胞下降、肝脾腫大、表情冷漠、玫瑰疹、相對緩脈肝臟脾臟膽囊腎臟骨髓并發(fā)癥腸穿孔腸出血典型病例病程為3-4W胸導(dǎo)管微生物學(xué)檢查法細(xì)菌學(xué)診斷標(biāo)本：胃腸炎取糞便嘔吐物或可疑食物腸熱癥在病程不同階段采取不同標(biāo)本；

發(fā)病1周取血；發(fā)病1-3周取骨髓液發(fā)病2周取糞便；發(fā)病3周取尿微生物學(xué)檢查細(xì)菌學(xué)診斷標(biāo)本

腸熱癥

食物中毒

敗血癥

第1周取靜脈血 可疑食物 血第1-3周取骨髓液 嘔吐物 第2周起取糞糞第3周起取尿

SS平板生化反應(yīng)血清學(xué)鑒定雙糖發(fā)酵等玻片凝集試驗沙門菌生化反應(yīng)KIA:K/A-+,H2S陽性,賴氨酸脫羧酶陽性,IMVC:-+-+,MIU:+--沙門菌血清學(xué)鑒定—肥達氏反應(yīng)一、原理用已知的標(biāo)準(zhǔn)診斷菌液【傷寒桿菌：菌體（O）抗原、鞭毛（H）抗原；副傷寒甲、乙、丙鞭毛（H）抗原共5種】與受檢血清作試管凝集試驗，測定受檢血清中有無相應(yīng)抗體及其效價，以協(xié)助傷寒、副傷寒疾病的診斷。二、器材及試劑標(biāo)準(zhǔn)診斷菌液（5種抗原：10ml/瓶）、生理鹽水（N.S）、待檢血清（兔血清）、試管、試管架、加樣槍或移液管（5mL、2mL、0.5mL每組3支）、一次性塑料滴管等。1三、實驗方法1.冰箱中取出診斷菌液平衡至室溫。2.將待檢血清作1：20、1：40、…..1：1280（每管0.5ml，每個稀釋倍數(shù)5管）稀釋，對照管加N.S0.5ml,然后逐管加入混勻后診斷菌液1d，充分振蕩混勻，標(biāo)記（時間、班級、組號），35~37°C放置16-20h觀察結(jié)果。（配液管：0.25ml血清+4.75mlN.S=5.0mL:1：20）3.5/6個同學(xué)一組，第二天中午1:30觀察結(jié)果。1:201:401:801:1601:3201:6401:1280傷寒O抗原0.25ml血清+4.75mlN.S=5.0mL:1：202.5ml2.5ml2.5mlN.S余2.5ml平分為5管，每管0.5ml：得5管1:20稀釋倍數(shù)的血清平分為5管，每管0.5ml：得5管1:40稀釋倍數(shù)的血清2.5mlN.S余2.5ml1:12801:201:401:801:1601:3201:640傷寒H抗原副甲H抗原副乙H抗原1:12801:201:401:801:1601:3201:6401:12801:201:401:801:1601:3201:6401:12801:201:401:801:1601:3201:640副丙H抗原1:201:401:801:1601:3201:6401:1280傷寒O抗原0.25ml血清+4.75mlN.S=5.0mL:1：20四、凝集結(jié)果判斷（上清液、沉淀）“＋＋＋＋”：強，完全凝集，液體澄清，輕搖大片凝集塊。

“＋＋＋”：大部分凝集，液體輕度渾濁，凝集塊小。

“＋＋”：中強，部分凝集，液體半澄清，凝集塊顆粒狀。

“＋”：弱，少量凝集，液體渾濁。

“－”：不凝集，液體渾濁，和對照相同。

++++

+++++五、效價判斷能出現(xiàn)明顯凝集（++）的血清最高稀釋度。例：測定某病人“O”凝集效價結(jié)果如下：1:201:401:801:1601:3201:6401:12804+3+3+2+2++-

六、臨床意義1.正常值：正常人血清中可能有低效價的抗體存在，其值高低存在地區(qū)差異，一般傷寒沙門菌“O”>1:80,“H”>1:160,副傷寒沙門菌“H”>1:80，有臨床意義；或者進行疾病早期、中后期兩次血清效價比較，后者增高4倍/4倍以上有診斷價值。2.“O”抗體出現(xiàn)早、消失快、主要為IgM類；“H”抗體出現(xiàn)遲、可持續(xù)陽性數(shù)年，主要為IgG類，O、H凝集效價都超過正常值，意義較大。1）、“O”高“H”不高：感染早期，傷寒沙門菌“O”抗原有交叉反應(yīng)，建議一周后復(fù)查。2）、“H”高“O”不高：疾病晚期、預(yù)防接種、非特異性回憶反應(yīng)。3.傷寒、副傷寒甲、乙有部分共同的O抗原，如O抗體效價增高，只能推斷為傷寒類疾病，不能區(qū)別傷寒或副傷寒。4.陰性反應(yīng)：未感染，感染輕，應(yīng)用有效抗菌藥物，接受皮質(zhì)激素治療者，患者過于衰弱等。七、注意事項1.應(yīng)在光亮處先觀察管底凝集狀態(tài)，后輕搖判定結(jié)果。2.使用前搖勻菌液，菌液有搖不散的凝集塊時不能使用。

弧菌科(Vibrionaceae)是一群氧化酶陽性，具有端極鞭毛，菌體短小、直或微彎的革蘭陰性桿菌。分為弧菌屬、氣單胞菌屬、鄰單胞菌屬和發(fā)光桿菌屬等四個菌屬?；【鷮偬卣鳎耗蛪A不耐酸，營養(yǎng)要求不高。生長迅速,在pH8.8~9.0的堿性蛋白胨水/堿性瓊脂平板上生長良好。在TCBS平板上為黃色菌落;在含亞碲酸鉀的平板上形成中心灰褐色的菌落。多數(shù)菌株生長都需要鹽；大多數(shù)氧化酶都為陽性；具有一端單一鞭毛。TCBS平板上菌落含亞碲酸鉀的4號平板特征弧菌屬氣單胞菌屬鄰單胞菌屬假單胞菌屬氧化酶++++葡萄糖發(fā)酵+++-O/129敏感性+/--+-肌醇產(chǎn)酸--+甘露醇產(chǎn)酸++-明膠液化++-+/-TCBS生長+---需要Na++---不發(fā)酵革蘭陰性桿菌包括假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、無色桿菌屬、不動桿菌屬、莫拉菌屬、金氏桿菌屬、黃桿菌屬、艾肯菌屬、土壤桿菌屬、黃單胞菌屬、叢毛單胞菌屬等。假單胞菌屬為需氧、有鞭毛、無芽胞、無莢膜的革蘭陰性桿菌，氧化酶試驗陽性。代表菌株為銅綠假單胞菌。42℃生長明膠液化鞭毛++單鞭毛···銅綠假單胞菌-+叢鞭毛···熒光假單胞菌--叢鞭毛···惡臭假單胞菌OF試驗：O氧化酶：+精氨酸水解：+葡萄糖酸氧化：+氮氣：+醫(yī)院環(huán)境及用品、臨床標(biāo)本分離培養(yǎng)基涂片檢查肉湯培養(yǎng)基血瓊脂平板SS、麥康凱瓊脂平板挑選可疑菌落（37℃培養(yǎng)18－24h觀察有無色素產(chǎn)生，色素鑒別接種金氏A、B培養(yǎng)基）無色素菌株42℃+綠膿素+綠膿菌熒光素銅綠假單胞菌假單胞菌鑒定程序1、形態(tài)觀察：G-桿菌，多形性，有鞭毛、菌毛、莢膜，無芽孢,產(chǎn)熒光素和綠膿素2、培養(yǎng)特性：專性需氧，4℃不生長42℃