第九章 原核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控

一、原核生物基因表達(dá)調(diào)控總論二、乳糖操縱元三、半乳糖操縱元四、色氨酸操縱元第九章：原核生物基因表達(dá)調(diào)控一、原核生物基因表達(dá)調(diào)控總論原核生物是單細(xì)胞生物，與外界環(huán)境密切相關(guān)。它們必須不斷地調(diào)整各種不同基因的表達(dá)以適應(yīng)營養(yǎng)條件和應(yīng)付各種不利的物理化學(xué)因素。基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，在其它水平上也常出現(xiàn)各種不同的調(diào)控方式。原核生物基因調(diào)控一般執(zhí)行如下規(guī)律?一個體系需要時被打開，不需要時被關(guān)閉。?基因的開與關(guān)是相對的。?開-關(guān)的活性可以通過轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)。?原核生物主要受到營養(yǎng)狀況和環(huán)境因素的影響?真核生物主要是受發(fā)育階段和激素水平的影響一、原核生物基因表達(dá)調(diào)控總論基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在二個方面?轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控?轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控一、原核生物基因表達(dá)調(diào)控總論幾個概念和要點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄起始、延伸和終止

E.coliRNA聚合酶σ因子

啟動子-10、-35序列啟動子效率操縱子

一、原核生物基因表達(dá)調(diào)控總論轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板的RNA的酶促合成。轉(zhuǎn)錄由RNA聚合酶催化，需要雙鏈DNA模板與前體核糖核苷酸（ATP、GTP、CTP和UTP）。合成方向：5’－3’。模板鏈稱為反義鏈。RNA聚合酶（RNApolymerase）:以一條DNA鏈或RNA為模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。是催化以DNA為模板（template）、三磷酸核糖核苷為底物、通過磷酸二酯鍵而聚合的合成RNA的酶。因?yàn)樵诩?xì)胞內(nèi)與基因DNA的遺傳信息轉(zhuǎn)錄為RNA有關(guān)，所以也稱轉(zhuǎn)錄酶。

催化轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶是一種由多個蛋白亞基組成的復(fù)合酶。如大腸桿菌的RNA聚合酶有五個亞基組成，含有α，β，β’，σ

，等4種不同的多肽，其中α為兩個分子，所以全酶（holoenzyme）的組成是α2ββ’σ

。α亞基與RNA聚合酶的四聚體核心（α2ββ’）的形成有關(guān)；β亞基含有核苷三磷酸的結(jié)合位點(diǎn)；β’亞基含有與DNA模板的結(jié)合位點(diǎn)；σ因子只與RNA轉(zhuǎn)錄的起始有關(guān)，與鏈的延伸沒有關(guān)系，δ因子的作用就是識別轉(zhuǎn)錄的起始位置，并使RNA聚合酶結(jié)合在啟動子部位。

一、原核生物基因表達(dá)調(diào)控總論細(xì)菌的RNA聚合酶活性形式(全酶)為15S，由5種不同的多肽鏈構(gòu)成，按分子量大小排列分別為β‘，β，σ，α和ω。每分子RNA聚合酶除有兩個α亞基外，其余亞基均只有一個，故全酶為β’βα2σω。

α亞基：與啟動子結(jié)合有關(guān)。β亞基：與轉(zhuǎn)錄的起始和延伸有關(guān)。β’亞基：與模板DNA的結(jié)合有關(guān)。一、原核生物基因表達(dá)調(diào)控總論

因子的結(jié)合和解離

因子的作用?

因子在酶與啟動子結(jié)合的過程中起重要作用：①提高酶辨認(rèn)啟動子的能力；②降低酶與DNA的非特異性結(jié)合；③促進(jìn)DNA開鏈；④提高RNA鏈合成起始的速度；⑤阻止酶分子聚合。全酶(holoenzyme)

核心酶(coreenzyme)

轉(zhuǎn)錄起始需解決的問題：1.RNA聚合酶必須準(zhǔn)確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域。2.DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板。啟動子與轉(zhuǎn)錄起始5′pppG53

35RNA-pol啟動子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5‘端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。因?yàn)榛虻奶禺愋赞D(zhuǎn)錄取決于酶與啟動子能否有效地形成二元復(fù)合物，故RNA聚合酶如何有效地找到啟動子并與之相結(jié)合是轉(zhuǎn)錄起始過程中首先要解決的問題。有實(shí)驗(yàn)表明，對許多啟動子來說，RNA聚合酶與之相結(jié)合的速率至少比布期運(yùn)動中的隨機(jī)碰撞高100倍。

啟動子與轉(zhuǎn)錄起始啟動子：含有RNA聚合酶特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列。長約40bp,內(nèi)含對于啟動子功能很關(guān)鍵的高度保守的短序列。

－10區(qū)（Pribnow盒）

:是幾乎所有啟動子都含有的一個6~8bp的序列，位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游10bp處，一般為TATAAT。

－35區(qū)：是另一個在大多數(shù)啟動子中都可找到的6~10bp序列（TTGACA）。位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游35bp處。啟動子與轉(zhuǎn)錄起始?轉(zhuǎn)錄的起始是基因表達(dá)的關(guān)鍵階段，而這一階段的重要問題是RNA聚合酶與啟動子的相互作用。啟動子的結(jié)構(gòu)影響了它與RNA聚合酶的親合力，從而影響基因的表達(dá)水平。-10區(qū)與-35區(qū)的最佳間距?-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離大約是16~19bp，小于15bp或大于20bp都會降低啟動子的活性。強(qiáng)啟動子-10和-35區(qū)之間的間隔為17±1bp增大或減小能明顯影響啟動子強(qiáng)度。啟動子與轉(zhuǎn)錄起始啟動子有強(qiáng)弱之分，雖然原核細(xì)胞僅靠一種RNA聚合酶就能負(fù)責(zé)所有RNA的合成，但它卻不能識別真核基因的啟動子。為了表達(dá)真核基因，必須將其克隆在原核啟動子的下游，才在原核表達(dá)系統(tǒng)中被轉(zhuǎn)錄。在原核生物表達(dá)系統(tǒng)中，通常使用的可調(diào)控的強(qiáng)啟動子有l(wèi)ac(乳糖啟動子)、trp(色氨酸啟動子)、PL和PR(λ噬菌體的左向和右向啟動子)以及tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動子)等。

啟動子與轉(zhuǎn)錄起始增強(qiáng)子可以提高轉(zhuǎn)錄的水平增強(qiáng)子(enhancer)指增加同它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率的DNA序列。增強(qiáng)子是通過啟動子來增加轉(zhuǎn)錄的。有效的增強(qiáng)子可以位于基因的5’端，也可位于基因的3’端，有的還可位于基因的內(nèi)含子中。增強(qiáng)子的效應(yīng)很明顯，一般能使基因轉(zhuǎn)錄頻率增加10～200倍，有的甚至可以高達(dá)上千倍。例如，人珠蛋白基因的表達(dá)水平在巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)增強(qiáng)子作用下可提高600～1000倍。增強(qiáng)子的作用同增強(qiáng)子的取向(5’-3’或3’-5’)無關(guān)，甚至遠(yuǎn)離靶基因達(dá)幾千kb也仍有增強(qiáng)作用。增強(qiáng)子1981年Benerji在SV40DNA中發(fā)現(xiàn)一個長約140bp的序列，它能大大提高SV40DNA／兔β—血紅蛋白融合基因的表達(dá)水平，這是發(fā)現(xiàn)的第一個增強(qiáng)子。它位于SV40早期基因的上游，由兩個正向重復(fù)序列組成，每個長72bp。目前發(fā)現(xiàn)的增強(qiáng)子多半是重復(fù)序列，一般長50bp，通常有一個8-12bp組成的“核心”序列，如SV40增強(qiáng)子的核心序列是5’—GGTGTGGAAAG—3’。

增強(qiáng)子首先被發(fā)現(xiàn)的增強(qiáng)子是SV40增強(qiáng)子。兩個增強(qiáng)子位于基因組的兩個串連的72nbp重復(fù)中，約在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游200bp處，每個72bp重復(fù)中有一個。缺失實(shí)驗(yàn)顯示兩個重復(fù)缺失一個并不產(chǎn)生什么影響，而如兩個均缺失即將大大降低活體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。有人發(fā)現(xiàn)，如果將β珠蛋白基因放在含有72bp重復(fù)的DNA分子中，它的轉(zhuǎn)錄作用在活體內(nèi)將增高約200倍以上，甚至當(dāng)此72bp順序位于離轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游1400bp或下游3000bp時仍有作用。各個基因中的增強(qiáng)子順序差別較大，但有一個基本的核心順序(coresequence)：AAAGGTGTGGGTTTGG

增強(qiáng)子RNA聚合酶全酶(

2)與模板結(jié)合

2.DNA雙鏈解開3.在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物5

-pppG-OH+

NTP

5

-pppGpN-OH3

+ppi轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物:RNApol(

2

)-DNA-pppGpN-OH3

啟動子與轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶與啟動子的相互作用(1)DNA解旋：在RNA聚合酶的作用下，約有17bp的DNA解旋，形成一個開放的復(fù)合物，許多啟動子中負(fù)超螺旋DNA可增強(qiáng)DNA解旋。(2)啟動子區(qū)的識別?RNA聚合酶首先與非特異性結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，形成過渡中間體，這種結(jié)合促進(jìn)了酶向啟動子移動，最終達(dá)到特異性結(jié)合，也稱為掃描式。啟動子與轉(zhuǎn)錄起始(3)酶與啟動子的結(jié)合

?RNA聚合酶與啟動子區(qū)結(jié)合，形成二元復(fù)合物，

然后開始合成RNA，形成三元復(fù)合物。

二元復(fù)合物=RNA酶+DNA

三元復(fù)合物=RNA酶+DNA+RNA

三元起始復(fù)合物：為全酶、模板DNA和新生RNA形成的復(fù)合物，亦可理解為由全酶、DNA和核苷三磷酸(NTP)構(gòu)成。于RNA聚合酶正確識別DNA模板上的啟動子后形成。

復(fù)合物中的核苷三磷酸一般為GTP，少數(shù)為ATP，因而原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5′端通常為三磷酸鳥苷（pppG）或腺苷三磷酸（pppA）。啟動子與轉(zhuǎn)錄起始啟動子與轉(zhuǎn)錄起始(4)RNA鏈起始：RNA合成無需引物，最初的9個核苷酸是在RNA聚合酶不沿DNA鏈移動或因子存在時合成的。RNA聚合酶首先要經(jīng)過多次無效的鏈起始，在成功起始后因子釋放出來。

第一個核苷三磷酸與第二個核苷三磷酸縮合生成3′-5′磷酸二酯鍵后，則啟動階段結(jié)束，進(jìn)入延伸階段。轉(zhuǎn)錄延長σ亞基脫離酶分子，留下的核心酶與DNA的結(jié)合變松，因而較容易繼續(xù)往前移動。核心酶無模板專一性，能轉(zhuǎn)錄模板上的任何順序，包括在轉(zhuǎn)錄后加工時待切除的居間順序。脫離核心酶的σ亞基還可與另外的核心酶結(jié)合，參與另一轉(zhuǎn)錄過程。隨著轉(zhuǎn)錄不斷延伸，DNA雙鏈順次地被打開，并接受新來的堿基配對(DNA-RNA)，合成新的磷酸二酯鍵后，核心酶向前移去，已使用過的模板重新關(guān)閉起來，恢復(fù)原來的雙鏈結(jié)構(gòu)。一般合成的RNA鏈對DNA模板具有高度的忠實(shí)性。RNA合成的速度，原核為25～50個核苷酸／秒，真核為45～100個核苷酸／秒。

轉(zhuǎn)錄延長

亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構(gòu)，沿著DNA模板前移；

2.在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。(NMP)n+NTP

(NMP)n+1

+PPi轉(zhuǎn)錄終止RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來不再前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來。

在原核中，發(fā)現(xiàn)終止信號存在于RNA聚合酶已經(jīng)轉(zhuǎn)錄過的序列之中。這種提供終止信號的結(jié)構(gòu)就稱為終止子。終止子可分為兩類:1、不依賴于蛋白質(zhì)輔因子就能實(shí)現(xiàn)終止作用。2、依賴蛋白輔因子才能實(shí)現(xiàn)終止作用。這種蛋白質(zhì)輔因子稱為釋放因子，通常又稱ρ因子。兩類終止子有共同的序列特征：在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)前有一段回文序列，回文序列的兩個重復(fù)部分(每個7～20bp)由幾個不重復(fù)的核苷節(jié)段隔開。回文序列的對稱軸一般距轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)16～24bp。兩類終止子的不同點(diǎn)是：不依賴ρ因子的終止子的回文序列中富含GC堿基對，在回文序列的下游方向又常有6～8個AT堿基對(在模板鏈上為A、在mRNA上為U)；而依賴ρ因子終止子中回文序列的GC對含量較少。在回文序列下游方向的序列沒有固定特征，其AT對含量比前一種終止子低。

轉(zhuǎn)錄終止5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`

RNA5

TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT...3

UUUU...…UUUU...…5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`莖環(huán)(stem-loop)/發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓；使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。轉(zhuǎn)錄終止操縱元原核生物一個轉(zhuǎn)錄單元可視為一個轉(zhuǎn)錄單位，稱為操縱元(operon)，包括若干個結(jié)構(gòu)基因及其上游(upstream)的調(diào)控序列。

5

3

3

5

結(jié)構(gòu)基因調(diào)控序列RNA-pol與RNA聚合酶結(jié)合啟動基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列為啟動子(promoter)。?法國Jacob和Monod等人1961年提出乳糖操縱元(lacoperon)學(xué)說。?大腸桿菌能適應(yīng)外界乳糖供應(yīng)的變化而改變利用乳糖的狀況，是通過乳糖操縱元的調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的，這是人們第一次開始認(rèn)識基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理。?是屬于可誘導(dǎo)操縱元(inducibleoperon)，這類操縱元通常是關(guān)閉的，當(dāng)受效應(yīng)物作用后誘導(dǎo)開放轉(zhuǎn)錄。二、乳糖操縱元乳糖操縱元與負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)LacZ：編碼β－半乳糖苷酶，它可以將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖；LacY：編碼半乳糖苷透性酶，它能將乳糖運(yùn)送透過細(xì)菌的細(xì)胞壁；LacA：編碼硫代半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶。

乳糖(lac)操縱元的表達(dá)調(diào)控

在沒有乳糖存在時，乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài)。此時，Ⅰ基因表達(dá)的乳糖阻遏蛋白與O序列結(jié)合，故阻斷轉(zhuǎn)錄啟動。阻遏蛋白的阻遏作用并非絕對，偶有阻遏蛋白與O序列解聚。因此，每個細(xì)胞中可能會有寥寥數(shù)分子β半乳糖苷酶、透性酶生成（本底表達(dá)）。乳糖(lac)操縱元的表達(dá)調(diào)控

當(dāng)有乳糖存在時，乳糖操縱子即可被誘導(dǎo)。真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖經(jīng)透性酶催化、轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，再經(jīng)原先存在于細(xì)胞中的少數(shù)β-半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)閯e乳糖。后者作為一種誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)型變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄，使β-半乳糖苷酶分子增加1000倍。正調(diào)控（positiveregulation）和負(fù)調(diào)控（negativeregulation）

誘導(dǎo)物與蛋白質(zhì)結(jié)合形成激活子復(fù)合物，激活子復(fù)合物與基因啟動子DNA序列結(jié)合，激活基因啟動轉(zhuǎn)錄，稱為正調(diào)控。

阻遏蛋白分子與基因啟動子DNA序列結(jié)合，阻礙RNA聚合酶的工作，使基因處于關(guān)閉狀態(tài)，稱為負(fù)調(diào)控。

乳糖(lac)操縱元的表達(dá)調(diào)控乳糖操縱元的正調(diào)控

在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，ATP在腺苷酸環(huán)化酶的作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)式AMP(cyclicadnosinemonophosphate,cAMP)。細(xì)胞內(nèi)一種代謝激活蛋白(cataboliteactivatingprotein,CAP)是cAMP的受體蛋白(cyclicAmpreceptorprotein,CRP)。cAMP與CAP結(jié)合，形成cAMP-CAP復(fù)合物。cAMP-CAP復(fù)合物是乳糖操縱元的正調(diào)控因子。

乳糖(lac)操縱元的表達(dá)調(diào)控cAMP含量與葡萄糖的分解代謝有關(guān)，當(dāng)細(xì)菌利用葡萄糖分解供給能量時，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，當(dāng)環(huán)境中無葡萄糖可供利用時，cAMP含量就升高。cAMP與CAP結(jié)合形成激活子復(fù)合物，并以二聚體的方式與特定的DNA序列結(jié)合。

當(dāng)cAMP-CAP復(fù)合物與乳糖操縱元的啟動子(o)的結(jié)合，使啟動子區(qū)域的DNA序列構(gòu)型變化，這種新構(gòu)型有利于提高RNA聚合酶的工作效率。乳糖(lac)操縱元的表達(dá)調(diào)控CAP的正性調(diào)控當(dāng)細(xì)胞中既有別乳糖與