北京地區(qū)實驗動物微生物、寄生蟲和遺傳質(zhì)量檢測結(jié)果分析

北京地區(qū)實驗動物微生物、寄生蟲和遺傳質(zhì)量檢測結(jié)果分析

生物實驗研究的四個因素（anima、pretel、信息、resour，簡稱aeir）在所有實驗研究中發(fā)揮著重要作用。然而，事實上，實驗動物的質(zhì)量往往是一個因素，它會影響整個實驗的質(zhì)量和水平。根據(jù)攜帶的微生物和寄生蟲的程度不同,可以分為普通級動物(conventionalanimals,CV)、清潔級實驗動物(cleananimals,CL)、無特定病原體動物(specificpathogenanimals,SPF)、無菌動物(germfreeanimals,GF)。從遺傳學(xué)的角度,可以分為近交系(inbred)、封閉群(outbred)和雜交群等。不同的實驗動物生產(chǎn)條件和成本不同,應(yīng)用的實驗范圍也不同。按照國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,需要對生產(chǎn)的實驗動物進行定期檢測,從而保證為用戶提供質(zhì)量合格的動物,以保證實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性,為生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展和生命科學(xué)研究奠定基礎(chǔ)和提供保障。北京市實驗動物質(zhì)量監(jiān)督抽檢是由北京市實驗動物管理辦公室依據(jù)《中華人民共和國動物防疫法》、《實驗動物質(zhì)量管理辦法》、《實驗動物許可證管理辦法》、《北京市實驗動物管理條例》、《北京市實驗動物許可證管理辦法》、《北京市實驗動物質(zhì)量檢測工作管理辦法》等相關(guān)法律法規(guī),對北京地區(qū)具有實驗動物生產(chǎn)許可證的企業(yè)單位進行一年兩次的抽樣,并委托具有檢測資質(zhì)的單位進行法定檢驗并出具檢驗報告,及時發(fā)布質(zhì)量抽檢信息,對不合格的動物及時進行處理,維護首都實驗動物質(zhì)量安全。本文對5年來北京地區(qū)實驗動物質(zhì)量抽檢結(jié)果進行分析,探討影響動物質(zhì)量的因素,為生產(chǎn)單位進行質(zhì)量管理提供參考。1材料和方法1.1材料表面被檢的實驗動物均來自北京地區(qū)具有《實驗動物生產(chǎn)許可證》且規(guī)模較大的實驗動物生產(chǎn)單位。各年度抽檢單位數(shù)量、動物品種等級及數(shù)量詳見表1。1.2抽樣數(shù)量及抽樣頻率北京市實驗動物管理辦公室依法對北京地區(qū)具備資質(zhì)的實驗動物生產(chǎn)單位進行抽樣,各品種各項目的抽樣數(shù)量均參照國家及地方標(biāo)準(zhǔn)總則的規(guī)定。樣品交由具備實驗動物質(zhì)檢資質(zhì)的檢測機構(gòu),依據(jù)國家及地方標(biāo)準(zhǔn)進行檢測,檢測方法、檢測儀器和試劑均參照國家及地方標(biāo)準(zhǔn)要求配備。1.3分析檢驗報告按照相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)及地方標(biāo)準(zhǔn),對檢測結(jié)果進行綜合判定,并由檢測單位出具檢驗報告。依據(jù)各年度的檢驗報告,進行5年間SPF級、清潔級、普通級病原感染的情況進行分類統(tǒng)計、免疫抗體不合格比例統(tǒng)計和遺傳質(zhì)量不合格批次統(tǒng)計,并進行各年度病原感染率統(tǒng)計和批次合格率統(tǒng)計,各比率均以百分率計。2結(jié)果2.15嗜肺巴斯德桿菌檢測從表2可見,SPF級動物中檢出了嗜肺巴斯德桿菌、小鼠肝炎病毒抗體、大鼠細(xì)小病毒抗體、鞭毛蟲和蠕蟲。其中,小鼠在2009年和2013年兩年都檢出嗜肺巴斯德桿菌陽性;2012年小鼠檢出了肝炎病毒抗體陽性(陽性率為1.4%),大鼠檢出了細(xì)小病毒抗體陽性(陽性率為25%)。鞭毛蟲和蠕蟲都只在2013年檢出,檢出率都未超過10%。2012年和2013年還抽檢過兩批次豚鼠共15只,均未檢出SPF級動物應(yīng)排除的微生物和寄生蟲,因此未列入表2。2.25大小鼠血藥濃度與健康指標(biāo)的相關(guān)性表12009-2013年,清潔級動物中檢測出了泰澤病原體、綠膿桿菌、支原體、仙臺病毒抗體和蠕蟲,詳見表3。其中豚鼠僅在2013年檢出了蠕蟲(陽性率為40.0%)。2010年清潔級大小鼠均檢出泰澤病原體,陽性率均小于2.0%;2011年兩者均檢出了綠膿桿菌,小鼠陽性率為6.7%,大鼠為20.0%。2012年僅在清潔級小鼠中檢出支原體(陽性率0.7%)和仙臺病毒抗體(1.3%)。2.35免疫抗體檢測結(jié)果普通級實驗動物的病原體感染情況如表4所示。豚鼠、犬、猴均檢測出弓形蟲陽性,其中豚鼠連續(xù)五年都有感染,陽性率成折線形發(fā)展。猴B病毒在2009年、2011年和2012年均檢出陽性,陽性率分別為50.0%、20.0%和35.0%。2009年還檢出犬布氏桿菌陽性(陽性率為3.2%),猴B病毒抗體陽性(陽性率為50.0%);2011年檢出豚鼠中淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒抗體陽性(陽性率為1.4%);2013年豚鼠和兔均檢出體外寄生蟲陽性,陽性率分別為5.3%和0.4%。5年來,在普通級動物中均檢出有免疫抗體不達(dá)標(biāo)的情況,其變化趨勢可見文后彩版Ⅰ-圖1。其中兔出血癥病毒免疫不達(dá)標(biāo)在5年中均存在,2011年最高,達(dá)到24.3%。犬溫?zé)岵《久庖卟贿_(dá)標(biāo)情況從2010年起連續(xù)存在4年,2012年最高達(dá)到58.1%。2013年還出現(xiàn)了犬瘟熱病毒、犬肝炎病毒和狂犬病病毒免疫均不達(dá)標(biāo)的情況。另外,實驗用小型豬為2013年下半年新增檢測品種,檢測了兩批次10份樣品,總體免疫水平都不高,豬繁殖與呼吸綜合征病毒以及乙型腦炎病毒無一達(dá)標(biāo),口蹄疫病毒、豬瘟病毒免疫合格率也沒有達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。2.45交系小鼠遺傳質(zhì)量檢測結(jié)果5年中共送檢了40批次的近交系小鼠和2批次近交系大鼠(LEW和WKY,2013年),但近交系大鼠只申請了微生物和寄生蟲等級監(jiān)測,沒有申請遺傳質(zhì)量檢測。故表5中僅列出了近交系小鼠遺傳生化標(biāo)記和H-2單倍型監(jiān)測的結(jié)果。2010年和2013年各有1批次C57BL/6J-ly5.1小鼠出現(xiàn)了不同程度的位點雜合,2013年另有一批次C57BL/6小鼠中的1只在酯酶-3位點發(fā)生了變異。2.5小鼠體內(nèi)病毒抗體檢測由于免疫抗體不達(dá)標(biāo)情況主要集中在普通級動物中,文后彩版Ⅰ-圖2僅顯示了2009年-2013年不同微生物、寄生蟲等病原各年度感染陽性檢出結(jié)果的趨勢圖。5年中共檢出15種病原體感染,其中10種為人獸共患病病原體:即綠膿桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、布氏桿菌、支原體、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒和猴B病毒。體外寄生蟲有弓形蟲、蠕蟲和鞭毛蟲。年度檢測狀況比較,2009年和2010年病原感染均檢出3項,分別為犬布氏桿菌和猴B病毒、弓形蟲和嗜肺巴斯德桿菌、泰澤病原體、弓形蟲。2012年檢出了支原體、皮膚病原真菌、小鼠肝炎病毒、大鼠細(xì)小病毒、仙臺病毒、猴B病毒和弓形蟲等7項病原感染,位居各年病原感染之首,且為5年中唯一一年在SPF級大小鼠中均檢測到人畜共患病毒抗體。2013年除在SPF級小鼠中檢測到嗜肺巴斯德桿菌陽性,其余四項均為寄生蟲(體外寄生蟲、弓形蟲、蠕蟲、鞭毛蟲)感染,且除弓形蟲以外的三項寄生蟲感染均只在2013年有檢出。2.65動物檢出量和檢疫批次從表6中可見,除2009年送檢單位為16家,此后每年送檢單位均在20家以上,2013年多達(dá)28家。抽檢動物數(shù)量自2009年的695只增長為2013年的900只,增幅達(dá)到了29.5%。抽檢批次從78批增至112批,逐年遞增。批次合格率由89.7%下降為68.8%,其中免疫不達(dá)標(biāo)成為了2010年以后批次合格率下降的主要原因。3實驗動物質(zhì)量檢測的現(xiàn)狀實驗動物質(zhì)量監(jiān)測是實驗動物科學(xué)的重要內(nèi)容,是確保實驗動物質(zhì)量的必要手段,經(jīng)過監(jiān)測合格的實驗動物才能保證動物實驗結(jié)果準(zhǔn)確性、規(guī)律性、重復(fù)性。同時,這也是實驗工作人員健康和生命的保證[9—11]。通過合理的質(zhì)量檢測,能夠排除實驗動物易攜帶的人畜共患病原體(如流行性出血熱、狂犬病、猴B病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、弓形蟲等),從而減少實驗動物在飼養(yǎng)、銷售和使用等環(huán)節(jié)對人群的感染。對于生產(chǎn)單位而言,動物質(zhì)量檢測更是企業(yè)盈利和良性發(fā)展以及動物生產(chǎn)和繁殖的保證。動物質(zhì)量容易受到氣候、飼養(yǎng)環(huán)境、飼料、飼養(yǎng)及繁育方式、人員、運輸?shù)榷喾N因素的影響。監(jiān)測的缺失將直接導(dǎo)致管理和生產(chǎn)的盲區(qū),實驗動物一旦染上傳染病,則種群難以凈化,一些烈性傳染病如鼠痘、兔病毒性出血癥等可致動物全軍覆沒,造成巨大經(jīng)濟損失。回顧北京地區(qū)2009-2013年實驗動物質(zhì)量檢測情況,不難發(fā)現(xiàn)5年間北京地區(qū)實驗動物抽檢的參檢單位數(shù)量、實驗動物數(shù)量、實驗動物品種均呈上升趨勢,而檢測的批次合格率則呈下降趨勢。這其中有新增單位和動物品種的因素,有某單位某時段某批次動物的偶發(fā)問題,也有常年檢測持續(xù)存在的病患(如弓形蟲、猴B病毒)等。這固然反映了動物生產(chǎn)單位在生產(chǎn)和管理過程中的漏洞,但同時也為監(jiān)管和檢測提出了新的課題。3.1加強質(zhì)量監(jiān)督和反饋,提高管理效率行業(yè)監(jiān)管對于規(guī)范和推動實驗動物科學(xué)發(fā)展具有十分重要的作用,但是如果過于體制化、模式固定,也就很難將監(jiān)測做到公正、及時、有效。如何避免實驗動物質(zhì)量波動問題的此消彼長并使其得到有效的控制,需要監(jiān)管部門在抽檢及結(jié)果處理方式上做出更科學(xué)合理的安排。北京市的實驗動物質(zhì)量監(jiān)督抽檢基本在每年的5月和10月集中進行,時間和方式多年約定俗成,一些生產(chǎn)企業(yè)難免會因為應(yīng)付監(jiān)測而在抽檢之前有所準(zhǔn)備。為使待檢單位站在同一個監(jiān)測基線,應(yīng)當(dāng)在可能的條件下增加隨機抽檢和盲檢的次數(shù),確保監(jiān)督抽檢的公平性和靈活性;同時,對不合格的動物及生產(chǎn)廠家建立跟蹤檔案,做好反饋和質(zhì)量示蹤;同時,也要加大信息資源平臺的建設(shè),加強信息發(fā)布,使法制監(jiān)管更加的公開和透明。隨著實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化的進程和實驗動物資源品種的日益豐富,要求實驗動物的監(jiān)測必須隨之發(fā)展,才能滿足生產(chǎn)企業(yè)和用戶市場的需求。2013年下半年,實驗用小型豬的微生物和寄生蟲等級監(jiān)測已納入法定監(jiān)督抽檢中,這正是上述變化的一個體現(xiàn)。對于新增品種,監(jiān)管部門就應(yīng)當(dāng)做出及時的反應(yīng),委托有資質(zhì)的檢測機構(gòu)開展新品種的質(zhì)量監(jiān)測。多年來微生物和寄生蟲等級監(jiān)測受到了監(jiān)管部門和生產(chǎn)廠家的重視,5年共送檢了459批次。而在遺傳監(jiān)測上,只有BALB/c,C57BL/6等少數(shù)幾個近交系小鼠納入了監(jiān)測范圍,雖有近交系大鼠送檢,也只申請了微生物和寄生蟲等級檢測。封閉群實驗動物的遺傳質(zhì)量檢測就更為落后,這其中除了發(fā)展標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)測方法困難的因素外,監(jiān)測導(dǎo)向的缺位也是遺傳質(zhì)量評價多年缺乏變化的重要原因。實驗動物的遺傳背景決定了其反應(yīng)特性,只有做好遺傳質(zhì)量監(jiān)測,才能充分保障種群的特異性。很多生產(chǎn)企業(yè)遺傳質(zhì)量控制意識淡薄,也很難建立遺傳檢測的條件,一旦發(fā)生遺傳變異,對于企業(yè)更是巨大的損失[13—15]。這就更需要監(jiān)管機構(gòu)加大遺傳檢測的力度,保障實驗動物的質(zhì)量。3.2檢測標(biāo)準(zhǔn)修訂5年監(jiān)測共檢出綠膿桿菌等15項病原感染(圖2),其中有10項均為人獸共患病病原體。普通級動物所檢測的8項免疫不達(dá)標(biāo)項目(圖1)對應(yīng)的病毒也均為人獸共患病病毒,一旦發(fā)生感染后果不堪設(shè)想。實驗動物檢測人員作為密切接觸動物和動物實驗的工作人員,必須要加強生物安全意識,務(wù)必按照檢測標(biāo)準(zhǔn)要求,在符合條件的實驗室進行檢測及處置,保障自身和環(huán)境的安全,保障檢測工作的順利進行。檢測標(biāo)準(zhǔn)一方面是檢測的依據(jù),另一方面也需要檢測人員在工作中不斷改進和更新。自2008年以來,實驗動物微生物、遺傳檢測國家標(biāo)準(zhǔn)均有不同程度的變更。在微生物等級檢測中,去掉了單核李斯特桿菌;遺傳檢測中則增加了肽酶-3的生化標(biāo)記位點。單核李斯特桿菌為人獸共患病病原體,去掉此檢測項目是否科學(xué)有待商榷。增加了肽酶-3位點檢測,在遺傳質(zhì)量評價中起到何種作用也需要更多數(shù)據(jù)支撐。美國、日本、歐盟、ICLAS在實驗動物質(zhì)量監(jiān)測中所使用的新方法(如分子生物學(xué)方法、基因測序、芯片技術(shù)、PRIA———PCR嚙齒類感染媒介檢測技術(shù)等[17—20])是否能夠適應(yīng)我國的檢測需要,有待檢測人員不斷的探索、總結(jié)和思考,從而提升自身的檢測技能,改進檢測方法,合理使用動物并提高檢測效率,助推實驗動物檢測的標(biāo)準(zhǔn)化進程。3.3質(zhì)量監(jiān)督檢驗動物抽檢數(shù)量的增加反映了動物生產(chǎn)數(shù)量和品種的增加。在總體的增長中,犬和猴的數(shù)量基本沒有變化,普通級豚鼠、兔以及SPF級的大小鼠的數(shù)量逐年上升,清潔級大小鼠的數(shù)量呈下降趨勢,清潔以上級別的豚鼠和兔則數(shù)量很少。同時,各年度的批次合格率也呈下降趨勢。實驗動物的質(zhì)量容易受到環(huán)境設(shè)施、理化因素、飼養(yǎng)方式、繁育運輸?shù)榷喾N因素的影響。任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)疏漏,都有可能造成質(zhì)量不合格,從而帶來經(jīng)濟損失。減少生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的失誤,必須強化飼育人員的責(zé)任心及繁育技術(shù)的普及,提高生產(chǎn)管理的水平。隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展,對SPF級以及更高級別實驗