第4章 滅菌、接種與培養(yǎng)

第四章滅菌、接種與培養(yǎng)一、滅菌（一）玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌：干熱滅菌是利用烘箱加熱到160～180℃的溫度來殺死微生物。通常采用170℃持續(xù)90分鐘來滅菌。干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎。滅菌時(shí)應(yīng)漸進(jìn)升溫，達(dá)到預(yù)定溫度后記錄時(shí)間。烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過多。到指定時(shí)間斷電后，待充分冷涼，才能打開烘箱。

（二）不耐熱的物質(zhì)采用過濾滅菌：一些生長調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。防細(xì)菌濾膜的網(wǎng)孔的直徑為0.45mm以下，當(dāng)溶液通過濾膜后，細(xì)菌的細(xì)胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，（三）空間采用紫外線和熏蒸滅菌(1)紫外線滅菌：在接種室、超凈臺上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌。細(xì)菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細(xì)菌的染色體變異，造成死亡。紫外線的波長為200～300nm，其中以260nm的殺菌能力最強(qiáng)，但是紫外線的穿透物質(zhì)的能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，且要求距照射物以不超過1.2米為宜。(2)熏蒸滅菌：用加熱焚燒、氧化等方法，使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴(kuò)散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關(guān)閉緊密即可?；瘜W(xué)消毒劑能使微生物的蛋白質(zhì)變性，或競爭其酶系統(tǒng)，或降低其表面張力，增加菌體細(xì)胞漿膜的通透性，使細(xì)胞破裂或溶解。一般說來，溫度越高，作用時(shí)間越長，殺菌效果越好。消毒劑的濃度一般是濃度越大，殺菌能力越強(qiáng)，但石炭酸和酒精例外。常用熏蒸劑是甲醛。熏蒸時(shí)，房間關(guān)閉緊密，按6～8ml/m3用量，將甲醛置于廣口容器中，加５g高錳酸鉀促進(jìn)揮發(fā)。冰醋酸也可進(jìn)行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。(四)一些物體表面用藥劑噴霧滅菌：物體表面可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手表面、植物材料表面等?？捎?0％的酒精反復(fù)涂擦滅菌，1％～2％的來蘇兒溶液以及0.25～1％的新潔爾滅也可以。(五)植物材料表面用消毒劑滅菌：從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶入培養(yǎng)基，便會造成培養(yǎng)基污染。首先，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細(xì)洗干凈。第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內(nèi)完成，準(zhǔn)備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸10-30s。處理完的材料在無菌條件下，待酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內(nèi)部材料。

第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取1～2種使用。

表4－2常用滅菌劑使用濃度及效果比較滅菌劑使用濃度持續(xù)時(shí)間(min)去除的難易效果次氯酸鈣9～10%5～30易很好次氯酸鈉2%5～30易很好氯化汞0.1～1%5～8較難最好抗菌素4～50mg/L30～60中較好而用升汞液滅菌的材料，因升汞殘毒較難去除，應(yīng)當(dāng)用無菌水涮洗8～10次，每次不少于3min，以盡量去除殘毒。滅菌時(shí)，把瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯或其它器皿中，記好時(shí)間，倒入消毒溶液，不時(shí)用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，以促進(jìn)材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使消毒徹底。在快到時(shí)間之前1～2min，開始把消毒液傾入一備好的大燒杯內(nèi)，要注意勿使材料倒出，傾凈后立即倒入無菌水，輕攪涮洗。滅菌時(shí)間是從倒入消毒液開始，至倒入無菌水時(shí)為止。在滅菌溶液中加吐溫-80或TritonX效果較好，這些表面活性劑主要作用是使藥劑更易于展布，更容易浸入到滅菌的材料表面。但吐溫加入后對材料的傷害也在增加，應(yīng)注意吐溫的用量和滅菌時(shí)間，一般加入滅菌液的1.5%，即在100ml加入1.5滴。最后一步是用無菌水沖洗，沖洗要每次3min左右，視采用的消毒液種類，沖洗3～10次左右。無菌水沖洗作用是免除消毒劑殺傷植物細(xì)胞的副作用。

二、無菌操作1、接種室要嚴(yán)格進(jìn)行空間消毒。接種室內(nèi)保持定期用1-3%的高錳酸鉀溶液對設(shè)備、墻壁、地板等進(jìn)行擦洗。2、工作人員進(jìn)入接種室前雙手必須進(jìn)行消毒，先用水和肥皂洗滌，操作前再用70%酒精擦試，操作時(shí)雙手不能隨便接觸未經(jīng)消毒的東西。

3、入室前穿好滅過菌的專用實(shí)驗(yàn)服，專用實(shí)驗(yàn)服要經(jīng)常保持清潔并消毒。

4、操作規(guī)程過程禁止不必要的談話和咳嗽。還要盡量減少工作人員在接種室內(nèi)的走動(dòng)。5、操作期間盡量把所用的器皿蓋子蓋好。刀、剪、鑷子等用具，一般在使用前浸泡在70％的酒精中，用時(shí)再在火焰上消毒，待冷卻后使用。6、每次使用前均需進(jìn)行用具消毒。工作結(jié)束，及時(shí)取出接種材料，然后清理臺面，再用５％的來蘇兒或石炭酸全面噴霧或打開紫外線照射半小時(shí)。三、接種接種是將經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理好外植體（如種子，根、莖、葉等離體器官），經(jīng)切割或剪裁成小段或小塊，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種。1、將初步洗滌及切割的材料放入燒杯，帶入超凈臺上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗．最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的４層紗布上或?yàn)V紙上。2、材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈?。如葉片切成0.5cm見方的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要?jiǎng)兂芍缓?～2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。3、用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。具體操作是：先解開包口膜，將培養(yǎng)瓶幾乎水平拿著，培養(yǎng)瓶口靠近酒精燈焰，將瓶口在火焰上方轉(zhuǎn)動(dòng)，讓瓶口里外灼燒數(shù)秒鐘。然后用鑷子夾取外植體送入瓶內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基上。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放(尖端向上)其它尚無統(tǒng)一要求。放置材料數(shù)量現(xiàn)在傾向少放，一旦培養(yǎng)物污染可以拋棄。接完種后，將瓶口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘，包上包口膜。四、培養(yǎng)培養(yǎng)是指把接種后的培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室(有光照、溫度條件)里，使之生長，分裂、分化形成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過程。（一）培養(yǎng)方法1、固體培養(yǎng)法：即用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。是現(xiàn)在最常用的方法。

該法設(shè)備簡單，易行。但養(yǎng)分分布不均，生長速度不均衡。并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。2、液體培養(yǎng)法：即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，常需要通過攪動(dòng)或振動(dòng)培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給，采用往復(fù)式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行培養(yǎng)，其速度一般為50～100r/min，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。(二)培養(yǎng)步驟1、初代培養(yǎng)：即接種某種外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。根據(jù)初代培養(yǎng)時(shí)發(fā)育的方向可分為：(1)頂芽和腋芽的發(fā)育：采用外源的細(xì)胞分裂素，可促使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側(cè)芽啟動(dòng)生長。形成一個(gè)微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結(jié)構(gòu)。

(2)不定芽的發(fā)育：在培養(yǎng)中由外植體產(chǎn)生不定芽,通常首先要經(jīng)脫分化過程,形成愈傷組織的細(xì)胞。然后，經(jīng)再分化，即由這些分生組織形成器官原基，最后形成完整植株。多數(shù)情況下它先形成芽，后形成根。(3)體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育：體細(xì)胞胚狀體類似于合子胚但又有所不同，它也通過球形，心形，魚雷形和子葉形的胚胎發(fā)育時(shí)期，最終發(fā)育成小苗。但它是由體細(xì)胞發(fā)生的。胚狀體可以從愈傷組織表面發(fā)生，也可從外植體表面已分化的細(xì)胞產(chǎn)生，或從懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生。初代培養(yǎng)外植體的褐變：外植體褐變是指在接種后，其表面開始變褐，有時(shí)甚至?xí)拐麄€(gè)培養(yǎng)基變褐的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中，會產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當(dāng)擴(kuò)散到培養(yǎng)基后，就會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。褐變的主要原因如下：(1)生理狀態(tài)：外植體的生理狀態(tài)不同，在接種后褐變程度也有所不同。一般來說，處于幼年期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴(yán)重。幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴(yán)重。(2)培養(yǎng)基成分：濃度過高的無機(jī)鹽會使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細(xì)胞分裂素的水平過高也會刺激某些花卉外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。(3)培養(yǎng)條件不當(dāng)：例如光照過強(qiáng)、溫度過高、培養(yǎng)時(shí)間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。防止、減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的措施(1)選擇合適的外植體：一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。(2)合適的培養(yǎng)條件：無機(jī)鹽成分、植物生長物質(zhì)水平、適宜溫度、及時(shí)繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。(3)使用抗氧化劑：在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外使用0.1％～0.5％的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。(4)連續(xù)轉(zhuǎn)移：對容易褐變的材料可間隔12～24小時(shí)的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7～10天后，褐變現(xiàn)象便會得到控制或大為減輕。

實(shí)驗(yàn)四植物外植體消毒和接種【目的】（2分）學(xué)習(xí)和掌握植物外植體表面消毒的常規(guī)方法?！驹怼浚?分）用于進(jìn)行組織培養(yǎng)的組織、器管和細(xì)胞稱為外植體。在植物組織培養(yǎng)中，外植體如果是帶菌的，在接種前都必須進(jìn)行表面消毒，這是取得培養(yǎng)成功的最基本的和重要的前提。常用消毒劑對外植體進(jìn)行消毒。接種是將經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理好的外植體，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種?！静牧稀浚?分）水稻種子【實(shí)驗(yàn)用品】（3分）1．試劑：0.1％氯化汞，75％乙醇無菌水，無菌培養(yǎng)皿，MS培養(yǎng)基。2．器具：無菌紙，一次性手套，酒精燈，標(biāo)簽紙，記號筆，超凈工作臺，燒杯，鑷子?！緦?shí)驗(yàn)步驟】（15分）1．外植體的滅菌:首先將水稻種子去殼，然后用75%酒精消毒30s，無菌水沖洗2次，再用0.1%氯化汞滅菌8min，用無菌水清洗6~8次，每次清洗時(shí)間3分鐘。2．接種前:用75％乙醇棉球檫拭超凈工作臺臺面，將培養(yǎng)基及用具放人工作臺