水果和蔬菜中維生素c的測定

水果和蔬菜中維生素c的測定

維生素是維持人體正常生理代謝所必需的有機(jī)化合物。它們中的大部分在人體內(nèi)不能合成或合成量不足,必須從食物中攝取。維生素C就是其中的一種。水果和蔬菜是人類維生素C的主要來源。由于它較易被空氣中的氧所氧化,易受溫度、pH、酶、銅和鐵離子、紫外線以及糖、鹽等影響,因此,了解果蔬鮮度、成熟度、栽培品種、收獲時間、儲藏期,了解維生素C在果蔬貯存、加工中的變化關(guān)系到產(chǎn)品食用品質(zhì)和人民健康,是果蔬主要的品質(zhì)指標(biāo),其定量分析在水果蔬菜營養(yǎng)分析中占據(jù)重要位置。了解維生素C測定的原理和方法對在實(shí)際工作中選擇合適的分析方法具有重要的指導(dǎo)意義。1還原型抗壞血酸維生素C又稱抗壞血酸(還原型,AsA),是己糖的衍生物。一般認(rèn)為,在生物體中,抗壞血酸是經(jīng)以下兩個途徑合成的:D-葡萄糖→D-葡萄糖醛酸↘L-抗壞血酸ID-半乳糖→D-半乳糖醛酸↗在自然界中,沒有D-抗壞血酸;后者可通過合成途徑得到。抗壞血酸在合適的條件下,可氧化成脫氫抗壞血酸(也稱氧化型抗壞血酸,DAsA),但這種變化是可逆的,即脫氫抗壞血酸也可還原為抗壞血酸;脫氫抗壞血酸可進(jìn)一步被氧化,生成二酮古洛糖酸,但這一過程是不可逆的。還原型抗壞血酸←→氧化型抗壞血酸—→二酮古洛糖酸II在許多水果和蔬菜中,維生素C主要以還原型抗壞血酸存在的,而氧化型抗壞血酸含量較低;在花椰菜和秋葵中后者能占全部抗壞血酸的50%。2生物活性的指標(biāo)根據(jù)測定目的和要求的不同,維生素C的測定可分為還原型抗壞血酸和總抗壞血酸兩種情況,后者包括還原型抗壞血酸,氧化型抗壞血酸和二酮古洛糖酸(DKG)的總和。后者無生物活性。水果和蔬菜中AsA+DAsA占新鮮植物體內(nèi)維生素C總量的90%以上。3維生素c在水果中的測量原理和特點(diǎn)3.1抗原酸還原劑的測定3.1.1asa含量的測定其原理是利用2,6-二氯酚靛酚鈉鹽(C12H6O2NCl2Na)在酸性條件下將還原型抗壞血酸氧化成氧化型抗壞血酸,而其本身被還原成無色的衍生物;當(dāng)還原型抗壞血酸全部被氧化時,過量的2,6-二氯靛酚鈉鹽呈現(xiàn)紅色,指示終點(diǎn)。該方法適于測定無色和淺色樣液或提取液中的AsA,無須特殊儀器,操作簡便、快速、準(zhǔn)確。由于大多數(shù)果蔬和其制品有顏色,影響了終點(diǎn)的準(zhǔn)確性。使用白陶土脫色和加1,2-二氯乙烷均不能得到理想的結(jié)果。作為對該法的改進(jìn),向一定量的AsA提取液中加入過量2,6-D,與AsA作用后,剩余的2,6-D被二甲苯萃取、比色。樣液中AsA含量與二甲苯萃取液中淺紅色呈線性負(fù)相關(guān)。因花青素不溶于二甲苯,故可測定深色樣品。應(yīng)用流動注射分析(FlowInjectionAnalysis,簡稱FIA),使該法的分析速度更快(120樣品/h)、靈敏(檢出限0.5ug/ml)。由于2,6-二氯靛酚和還原型抗壞血酸具有不同的電位(2,6-二氯靛酚的氧化還原電位是150mV,AsA的氧化還原電位是100mV),利用鉑和氯化銀復(fù)合電極測定其電位差的變化,可準(zhǔn)確地測定樣液中AsA的含量。該法適宜色澤較深樣品中AsA的測定。溶解氧測定是利用極譜分析法原理進(jìn)行的,其基本電路與電位滴定相似。但樣品中同時存在的Fe2+、Sn2+、SO2、SO3、S2O32-等還原性雜質(zhì)對本法則有干擾。扣除樣品中內(nèi)源還原性物質(zhì)是對2,6-二氯靛酚法的一個改進(jìn)。3.1.2殘余碘的存在時其原理是基于AsA還原碘,自身氧化DAsA,而碘可由碘酸鉀還原碘化鉀來得到,當(dāng)多余碘存在時,淀粉呈藍(lán)色,指示終點(diǎn)。反應(yīng)式如下:KI+KIO3+6H+→2K++3H2O+I2III還原型抗壞血酸+I2+2H+→氧化型抗壞血酸+2HIIV該法簡便,但在測定深色樣品時,準(zhǔn)確度欠佳。3.1.3dasa的化學(xué)計(jì)量其原理是三價(jià)鐵離子被AsA還原二價(jià)鐵離子,后者與4,7-二苯基-1,10-菲咯啉(Bathophenanthroline,BP)生成紅色絡(luò)合物,其強(qiáng)度與樣品中AsA含量有化學(xué)計(jì)量關(guān)系。該法具有快速,靈敏的優(yōu)點(diǎn);此外,樣品中DAsA還可被Dithiothreitol(DTT)還原為AsA,同時測定DAsA的含量。采用流動注射分析停留技術(shù)還可實(shí)現(xiàn)AsA與果蔬常用抗褐變劑L-半胱氨酸的同時測定。3.1.4feiii-二氮雜菲絡(luò)合物的穩(wěn)定性測定是在pH=5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中,抗壞血酸與鐵(III)和1,10-二氮雜菲溶液相互作用,形成橘紅色的Fe(II)-二氮雜菲絡(luò)合物,在波長510nm處,吸光度與50ml抗壞血酸含量在10~200ug濃度內(nèi)呈線性關(guān)系。該法的特點(diǎn)是簡便快速,靈敏度高,干擾少。3.1.5cu2+催化劑氧化法其原理是還原型維生素C(AsA)在紫外區(qū)243.8nm處有最大吸收峰,以Cu2+作催化劑,利用溶解氧,將在243.8nm處有最大吸收的AsA選擇性氧化為243.8inm處無最大吸收峰的DAsA,進(jìn)行本底校正,此法具有簡便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。3.1.6濁度與asa含量的關(guān)系其原理是在酸性提取液中的AsA,可被亞硒酸氧化成DAsA,后者還原成元素硒,在一定條件下,其溶液中形成穩(wěn)定的懸濁液。當(dāng)20~50ml浸出液中AsA含量在0~4mg時,濁度與AsA含量成正比。樣品中含有單寧、山梨酸、還原酮類不干擾測定。Fe2+、SO2在常溫下干擾不明顯,僅亞錫離子有干擾。3.1.7高效液相色譜法hplc此法的優(yōu)點(diǎn)不僅操作簡便,分離時間短,對結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的維生素C,尤為適合;缺點(diǎn)是所用儀器較為昂貴。3.1.8抗壞血酸含量其原理是用溴水將AsA氧化成DAsA,而后者與鄰苯二胺縮合,可用于極譜定量測定抗壞血酸含量。脫氫型的還原糖、還原酸等對測定有干擾,可用氯仿萃取分離干擾物質(zhì)后進(jìn)行測定。3.2維生素c總量的測量3.2.1,3-二酮-5-甲基苯磺酸法此法為測定維生素C總量最常用的方法。其原理是用活性炭把AsA氧化成DAsA,在pH5以上時,后者分子重排,其內(nèi)酯環(huán)裂開生成2,3-二酮古樂糖酸(DKG),與硝基苯肼偶聯(lián),生成紅色的脎,其呈色強(qiáng)度與DKG濃度成正比;如果再測定出DKG、DKG+DAsA的含量,則可計(jì)算出AsA、DAsA的含量。該法雖然測試過程長、須嚴(yán)格掌握測試條件,但其準(zhǔn)確度和精密度均較高。3.2.2熒光強(qiáng)度測定其測定維生素C的基本原理是:樣品中的AsA被氧化成DAsA,并與鄰苯二胺反應(yīng),生成熒光物質(zhì)喹喔啉(Quinoxaline)衍生物,熒光強(qiáng)度與DAsA的濃度成正比,用熒光計(jì)測定熒光強(qiáng)度。該法具有較強(qiáng)的專一性,樣品中有些成分會造成干擾,可作空白試驗(yàn)校正干擾物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光。此法的優(yōu)點(diǎn)是,生成熒光物質(zhì)所需時間短,操作簡單,能在短時間內(nèi)測定維生素C總量和分開測定AsA、DAsA的含量。3.2.3比色法終點(diǎn)果蔬中的維生素C,在過氧化氫存在下,添加合成底物1,4-二氨基苯,通過過氧化物酶氧化顯色,作為維生素C氧化終點(diǎn),然后比色測定。該法的特點(diǎn)是不需要昂貴的儀器,適應(yīng)性強(qiáng),容易掌握,費(fèi)用低,檢測快速,不需要預(yù)先純化所分析的試樣。在上述測定維生素C的方法中,有些既可以測定AsA,或DAsA,又可測定維生素C總量,如分光光度法、紫外光度法、2,4-二硝基苯肼法、熒光分光光度計(jì)法、過氧化物酶法,在同時測定AsA和DAsA時