白花敗醬草化學(xué)成分的分離與鑒定

白花敗醬草化學(xué)成分的分離與鑒定

白屈菜又名苦菜、苦齋和鹿腸。它是白色雜草科的一種多年生草本植物，分布在中國(guó)東部、光華、華南和西南部。因其含有多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等有益成分而被人們廣泛食用,它也是一種常用中藥,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,曾被《中國(guó)藥典》(1977年版)收載,具有清熱利濕、解毒排膿、活血化瘀、清心安神、促進(jìn)肝細(xì)胞再生、改善肝功能、增強(qiáng)抑菌和抗病毒等作用,臨床上常用于治療闌尾炎、痢疾、肝炎、扁桃體炎、流行性腮腺炎、癰腫等癥。有關(guān)白花敗醬草化學(xué)成分研究報(bào)道的較少,僅涉及幾種環(huán)烯醚萜類化合物。因此,進(jìn)一步研究白花敗醬草的化學(xué)成分,對(duì)闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制、開發(fā)現(xiàn)代中藥新藥和充分利用我國(guó)的藥材資源等具有意義。采用柱色譜法和重結(jié)晶等傳統(tǒng)的分離制備方法分離植物中的有效單體,不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力、污染環(huán)境,而且所用固定相對(duì)樣品有不可逆性吸附作用。高速逆流色譜(HSCCC)是一種較新型的液液分配色譜技術(shù),它不用任何固體支撐體或載體而克服了傳統(tǒng)分離方法對(duì)樣品的不可逆性吸附作用,因而樣品回收率高,同時(shí)還具有應(yīng)用范圍廣、儀器操作簡(jiǎn)單、分離量大等優(yōu)點(diǎn)。本研究中采用溶劑提取和萃取法得到粗提物,以此粗提物直接進(jìn)行高速逆流色譜分離純化,經(jīng)一步洗脫分離得到純度高于98%的木犀草素、5-羥基-7,4′-二甲氧基黃酮和5-羥基-7,3′,4′-三甲氧基黃酮,3者均為首次從敗醬屬植物中發(fā)現(xiàn)。該法操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)物純度高。目前,尚未見快速、簡(jiǎn)便從白花敗醬草中分離多種成分的報(bào)道。1cc設(shè)置的泵及儀器TBE-300A高速逆流色譜儀(深圳同田生化技術(shù)有限公司)。聚四氟乙烯管纏繞在3個(gè)水平軸上形成螺旋管(管直徑2.6mm,分離體積300mL),20mL進(jìn)樣圈。該HSCCC還配備了柱塞式泵(S系列,北京圣益通技術(shù)開發(fā)有限公司),UV-Ⅱ型檢測(cè)器(中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)所),N2010色譜工作站(浙江大學(xué)智能信息工程研究所)。Waters高效液相色譜儀,包括515泵,2487檢測(cè)器,20μL定量圈,N2000色譜工作站(浙江大學(xué)智能信息工程研究所)。白花敗醬草購(gòu)自上海童涵春中藥飲片廠,經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)生藥學(xué)教研室秦路平博士鑒定,實(shí)驗(yàn)中所用石油醚、乙酸乙酯、甲醇、正己烷、冰醋酸均為分析純(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司),乙腈為色譜純(默克),水為自制重蒸餾水,并經(jīng)微孔濾膜過濾。2提取和分離2.1乙醇-乙酸乙酯法將藥材適當(dāng)粉粹,稱取粗粉3.0kg,加8倍量體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇,回流提取2次,每次2.0h。過濾,合并濾液,減壓回收乙醇,得浸膏。取浸膏加適量水混懸后,依次用石油醚和乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯萃取物減壓濃縮后真空干燥得淺黃色粉末46.5g(提取率為1.55%),置冰箱保存,備用。精密稱取400mg進(jìn)行高速逆流色譜分離制備。2.2流動(dòng)相及流動(dòng)相色譜柱:LichrospherC18(6.0mm×150mm,5μm)(漢邦科技有限公司),流動(dòng)相為乙腈-水-冰醋酸=60∶40∶2,流速1.0mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)254nm,柱溫為室溫,進(jìn)樣量20μL。在此條件下乙酸乙酯萃取物色譜圖見圖1-A,峰1,2,3分別為木犀草素、5-羥基-7,4′-二甲氧基黃酮、5-羥基-7,3′,4′-三甲氧基黃酮。2.3分離木生長(zhǎng)特性的測(cè)定在逆流色譜中,一個(gè)好的溶劑系統(tǒng)應(yīng)滿足下列要求:①固定相要有較高的保留率;②兩相溶劑系統(tǒng)的分層時(shí)間短于30s;③分配系數(shù)(K)應(yīng)當(dāng)接近1;④兩色譜峰的分離度(α)大于1.5。分配系數(shù)太大或太小都不利于分離,分離度太小則容易造成峰重疊,太大則易引起色譜峰擴(kuò)寬。溶劑體系的選擇對(duì)分離效果至關(guān)重要,本研究中,根據(jù)所分離化合物特性,考察了正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水這一溶劑體系在不同配比條件下目標(biāo)成分的分配情況,并根據(jù)文獻(xiàn)來計(jì)算分配系數(shù)與分離度值,即分配系數(shù)K=Aupper/Alower,分離度α=K2/K1,K2>K1,結(jié)果見表1。由此選擇正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水=1∶0.6∶0.6∶1為分離木犀草素、5-羥基-7,4′-二甲氧基黃酮與5-羥基-7,3′,4′-三甲氧基黃酮所用的兩相溶劑系統(tǒng)。在分液漏斗中配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水=1∶0.6∶0.6∶1兩相溶劑體系,充分振搖后靜止,使用前分取上下相,超聲脫氣后泵入逆流色譜儀。先將HSCCC分離管中充滿上相,調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為800r·min-1,再以2.0mL·min-1流速泵入下相,待流動(dòng)相從柱出口流出,表明兩相在分離管中建立了動(dòng)態(tài)平衡,由進(jìn)樣閥進(jìn)樣,流出液用紫外檢測(cè)器在254nm處進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)記錄色譜圖,根據(jù)色譜圖接收目標(biāo)成分。結(jié)果在6h內(nèi)共分離得到3個(gè)流分,即“Ⅰ”、“Ⅱ”和“Ⅲ”,逆流色譜圖見圖2。3為木新型水解環(huán)境素的合成所得流分經(jīng)HPLC分析表明Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ均為單一色譜峰色譜圖見圖1-B,C,D,峰純度分別為98.8%,98.2%和99.1%(峰面積歸一化法)。各流分減壓回收溶劑后真空干燥得26mg化合物Ⅰ,15mg化合物Ⅱ和21mg化合物Ⅲ,3者均為淺黃色粉末。流分Ⅰ:淺黃色粉末,mp235～238℃,UVλnm:358,259,270(MeOH)。TOF-MS:285[M-H]-,571[2M-H]-。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:13.02(1H,brs,5-OH),7.45(1H,dd,J=2.5,8.5Hz,6′-H),7.40(1H,d,J=2.5Hz,2′-H),6.91(1H,d,J=8.5Hz,5′-H),6.71(1H,s,3-H),6.47(1H,d,J=2.0Hz,6-H),6.59(1H,d,J=1.6Hz,H-8)。13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:163.8(C-2),103.3(C-3),181.4(C-4),161.4(C-5),99.0(C-6),164.9(C-7),93.9(C-8),157.3(C-9),103.9(C-10),118.8(C-1′),113.1(C-2′),145.9(C-3′),149.9(C-4′),116.0(C-5′),121.7(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致,可以斷定Ⅰ為木犀草素。流分Ⅱ:淺黃色粉末,mp143～145℃,鹽酸鎂粉反應(yīng)呈陽性。ESI-MSm/z:321[M+Na]+。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:6.41(1H,d,J=2.0Hz,6-H),6.83(1H,d,J=2.0Hz,8-H),6.98(1H,s,3-H),7.12(2H,d,J=9.0Hz,3′,5′-H),8.10(2H,d,J=9.0Hz,2′,6′-H),12.95(1H,s,5-OH)。13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:163.8(C-2),103.8(C-3),182.2(C-4),161.4(C-5),98.2(C-6),165.4(C-7),92.9(C-8),104.4(C-10),157.4(C-9),122.9(C-1′),128.6(C-2′,C-6′),114.8(C-3′,C-5′),162.6(C-4′),55.8(4′-OCH3),56.3(7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致,可以確認(rèn)Ⅱ?yàn)?-羥基-7,4′-二甲氧基黃酮。流分Ⅲ:淺黃色粉末,mp167～169℃,鹽酸鎂粉反應(yīng)呈陽性。ESI-MSm/z:351[M+Na]+;1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:3.91(9H,s,OCH3×3),6.42(1H,d,J=2.0Hz,6-H),6.82(1H,d,J=2.0Hz,8-H),7.09(1H,s,3-H),7.15(1H,d,J=8.5Hz,5′-H),7.60(1H,d,J=2.0Hz,2′-H),7.73(1H,dd,J=2.0,8.5Hz,6′-H),12.91(1H,s,5-OH)。13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:161.3(C-2,C-5),104.2(C-3,C-10),182.3(C-4),98.3(C-6),165.4(C-7),92.9(C-8),157.5(C-9),122.9(C-1′),109.7(C-2′),149.2(C-3′),152.4(C-4′),111.9(C-5′),120.4(C-6′),55.7(7-OCH3),56.1(4′-OCH3),56.3(3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致,可以確認(rèn)Ⅲ為5-羥基-7,3′,4′-三甲氧基黃