細胞與胞外基質(zhì)微環(huán)境的物理力學相互作用

細胞與胞外基質(zhì)微環(huán)境的物理力學相互作用

0細胞牽引顯微方法一般來說，動物組織中的細胞是被膜包圍的一個小單元。它充滿了濃度較高的化合物溶液，具有獨特的能力，即通過生長和分裂產(chǎn)生自己的提取物。細胞是生命體的結(jié)構(gòu)與生命活動的基本單元,在細胞內(nèi)部實現(xiàn)著物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)換和信息傳遞等一系列相互交織而又精確有序的生命過程,從而展現(xiàn)一個生機盎然、絢麗多姿的生命世界。細胞一般生活在細胞外基質(zhì)(即由分泌蛋白和多糖組成的充滿胞外空間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu))所形成的微環(huán)境中,細胞與細胞外基質(zhì)之間主要通過粘著斑(FocalAdhesion)連接在一起。粘著斑是由眾多蛋白分子構(gòu)成的“超分子復(fù)合體”,呈橢圓形(一般長軸尺寸為2～5μm,短軸為1～2μm),其上面至少包含150種以上的不同功能蛋白分子,它一端通過踝蛋白(Talin)與細胞內(nèi)肌動蛋白骨架相銜接,另一端通過跨膜蛋白——整合素(Integrin,也稱整合蛋白)與細胞外基質(zhì)相連,從而實現(xiàn)細胞與胞外基質(zhì)的粘附。細胞內(nèi)肌動蛋白骨架產(chǎn)生的收縮力可以經(jīng)由粘著斑傳遞到細胞外基質(zhì),產(chǎn)生所謂的細胞牽引力(CellularTractionForces)[13,14,15,16,17,18,19,20]。在此過程中,粘著斑上分布的豐富蛋白分子也會積極主動地感知外部微環(huán)境的物理化學變化,適時做出相應(yīng)的功能性響應(yīng)[21,22,23,24,25,26,27,28]。近些年來的研究表明,細胞與胞外基質(zhì)微環(huán)境之間的這種生物物理力學相互作用涉及許多復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導通路,不僅對于細胞的增殖、分化、收縮、遷移以及凋亡等基本生理過程起著重要的調(diào)控作用[29,30,31,32,33,34],而且也直接與諸多嚴重疾病(例如心血管疾病和腫瘤疾病)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在單細胞水平上定量研究細胞生物物理力學活動規(guī)律及特點具有重要的生理病理學意義。單個細胞與外部基質(zhì)(基底)之間的作用力一般在納牛頓量級(甚至更小),作用區(qū)域一般不超過50×50μm2,近幾年發(fā)展起來的細胞牽引力顯微鏡方法(CellularTractionForceMicroscopy),實現(xiàn)了在不破壞細胞生理活性的前提下,定量表征細胞與細胞外基質(zhì)(彈性基底)之間的力學相互作用。細胞牽引力顯微鏡方法的基本思路是將細胞培養(yǎng)在軟的凝膠(例如聚丙烯酰胺(Polyacrylamide,PAA))或高分子聚合物(例如聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS))彈性基底表面,通過分析計算細胞引起的基底彈性變形進而求得細胞牽引力場(如圖1所示)。采用上述思路求解時,細胞在彈性基底上運動(例如細胞收縮和遷移)過程中各個時刻牽引力變化分布圖都可以可視化在計算機屏幕上,因此這種技術(shù)通常形象地稱作“細胞牽引力顯微鏡方法”。細胞牽引力測量方法始于上個世紀八十年代初Harris等人的開創(chuàng)性研究工作,他們當時設(shè)法在硅酮液體表面形成一層硅膠薄膜,然后把成纖維細胞培養(yǎng)在這層薄膜之上,首次觀察到了牽引力導致的硅膠薄膜褶皺變形,并以此估算了細胞牽引力大小。后來,Burton等人利用紫外照射的方法軟化含三甲基末端的苯甲基聚硅氧烷,獲得了更加柔軟的基底膜,從而提高了這一方法的分辨率。然而,由于基底膜褶皺變形具有高度非線性特點,致使牽引力求解十分困難,因此Harris等人開創(chuàng)的測力方法只能獲得半定量甚至是定性的計算結(jié)果。1997年,Pelham和Wang等人提出了應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠材料制作彈性薄膜進行細胞牽引力測量的方法。聚丙烯酰胺是一種疏松多孔的高聚物,由丙烯酰胺與二丙烯酰胺交聯(lián)而成,通過調(diào)節(jié)兩種組分的配比,可改變孔徑大小,形成不同交聯(lián)程度、不同硬度的凝膠彈性基底。此種凝膠材料不僅透明,無毒,生物相容性好,適合細胞在其上面粘附生長,而且在制作過程中可以方便地摻入熒光顆粒,在薄膜表面形成隨機分布的熒光標記圖案(類似于散斑圖,如圖1所示),便于使用光力學測量方法進行基底變形分析。以聚丙烯酰胺凝膠彈性基底為例,細胞牽引力顯微鏡方法主要包括如下幾個步驟:(1)根據(jù)需要確定丙烯酰胺與二丙烯酰胺的濃度配比,同時摻入適量的熒光標記顆粒,制作硬度合適的彈性薄膜基底,并在基底表面形成隨機熒光標記圖案;(2)在其上面粘附生長細胞,然后在熒光顯微鏡下觀察細胞活動導致的彈性基底表面變形,并拍攝變形前后的基底熒光“散斑”圖案;(3)運用圖像處理方法提取彈性基底表面變形信息;(4)根據(jù)基底變形反演計算細胞牽引力場。應(yīng)該指出,由測量得到的彈性基底位移場求解細胞牽引力場的過程屬于數(shù)學物理問題中的一類病態(tài)“反問題”,這使得無論是理論分析還是數(shù)值計算都有特定的困難。所謂病態(tài)反問題,主要表現(xiàn)為數(shù)字物理方程的解不是連續(xù)地依賴于觀測數(shù)據(jù)(輸入數(shù)據(jù)),即觀測數(shù)據(jù)的微小偏差都可能導致解的很大變化。對于實際問題,一般觀測數(shù)據(jù)的誤差(或噪聲)在所難免,因此,基于這些或多或少帶有誤差的觀測數(shù)據(jù)反推得到的方程解極有可能偏離真解甚遠。如何通過盡可能多的先驗知識,運用適當?shù)臄?shù)學物理方法反演得到穩(wěn)定可靠、高時空分辨率的引力場是細胞牽引力顯微鏡方法的核心所在,也是本文關(guān)注的重點。為此,我們將首先簡要介紹一下彈性基底位移場的求解方法,然后著重論述細胞牽引力顯微鏡反演方法的最新研究進展。1興趣讀者介紹在細胞牽引力顯微鏡方法中,彈性基底膜的制備、力學性能表征、細胞培養(yǎng)與顯微觀察等前期實驗技術(shù)相對簡單,且已經(jīng)形成了比較完善的實驗流程,限于篇幅,本文將不再進行詳細介紹,有興趣的讀者可以參考相關(guān)文獻[30,41,43,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60]。歸納起來,基底位移場的求解方法可以大致分為兩種,即基于模式識別技術(shù)的熒光粒子位移跟蹤方法(PatternRecognitioninIdentifyingPairsofBeads)和數(shù)字圖像相關(guān)方法(DigitalImageCorrelation,DIC)。1.1彈性基底熒光顆粒點位置信息該方法通過精確匹配彈性膜基底變形前后其表面熒光微顆粒位置信息,達到快速準確獲取基底彈性變形信息的目的。用模式識別技術(shù)提取彈性基底位移場的基本思路如圖2所示。首先,把變形前的彈性基底熒光圖作為參考圖像,并在其中任選一個熒光顆粒點m,找到其鄰近熒光顆粒點n;其次,在變形后的彈性基底熒光圖像中分別預(yù)搜索熒光顆粒點m和n的可能位置集合{M}和{N};最后,精確匹配從集合{M}到{N}所有可能情況,這樣,根據(jù)基底彈性位移場唯一確定性這一限制條件,我們總能確定熒光顆粒m和n之間相對位置。依次類推,就可以獲得基底彈性變形后所有熒光顆粒點相對位置信息。此方法通過對單個的熒光粒子位置的跟蹤方式,最終可獲得所有粒子的位移,整個彈性基底的位移場可以通過插值的方法計算出來。顯而易見,這種方法的計算精度嚴重依賴于熒光標記顆粒的分布密度和分布的均勻性,當表面熒光顆粒分布密度較高時,單個熒光粒子的位移場的“錯誤識別”也會增多,當表面熒光顆粒分布密度較低時,遠離熒光顆粒的位置處的位移需要由插值方法求得,這在一定程度上也會損失精度。1.2亞像素搜索算法眾所周知,數(shù)字圖像相關(guān)方法主要通過一系列的圖像互相關(guān)運算,來獲得變形后的圖像相對于變形前圖像的位移(以及應(yīng)變)場。具體來說,在參考圖中選取適當?shù)?矩形)子區(qū)域A,然后在變形圖中的對應(yīng)區(qū)域附近搜索該子區(qū)域,計算它們的互相關(guān)系數(shù),則相關(guān)系數(shù)的峰值所在的位置就代表變形前A區(qū)域當前最可能的位置,通過采用亞像素搜索算法,該方法得到的位移場能夠精確到亞像素水平。數(shù)字圖像相關(guān)技術(shù)最早應(yīng)用于實驗固體力學領(lǐng)域,現(xiàn)已在材料力學行為測試、微尺度變形測量等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[66,67,68,69,70,71]。目前,基于數(shù)字圖像相關(guān)技術(shù)的位移(以及應(yīng)變)提取算法已經(jīng)開始應(yīng)用于求解細胞基底圖像變形場。根據(jù)基底表面熒光粒子分布的特征(包括粒子的分布密度、局部粒子分布差異性特征),這種方法能夠比較準確高效地計算出基底圖像的全場位移和應(yīng)變信息。2反欺凌法的方法2.1基于boussi現(xiàn)行積分核的細胞牽引場一般細胞的直徑大約10～40μm,而近似橢圓形的粘著斑長軸大約2～5μm,短軸大約1～2μm,基底的最大變形一般不超過3μm,而(聚丙烯酰胺)彈性基底厚度一般都至少是60～70μm,理論分析表明對于細胞與彈性基底相互作用而言,這種厚度的基底可以采用基于半空間無窮厚度假設(shè)的Boussinesq基本解來分析處理。若把每一個孤立的基底粘附位置所承擔的細胞骨架收縮力看成一個集中力F(r),且這些集中力都切向作用于基底表面,用u(r)表示由此引起的彈性基底表面位移,則細胞牽引力F(r)和基底表面位移u(r)之間滿足下面的第一類Fredholm積分方程:ui(r)=∫Gij(r-r′)Fj(r′)dr′(1)其中,r=(x,y)T=(x1,x2)T代表位置向量,積分號內(nèi)重復(fù)出現(xiàn)的下標(亞指標)項代表求和運算;Gij是基于Boussinesq基本解的格林函數(shù)(積分核),可表示為如下形式:Gij(d)=1+νπEd[δij(1-ν)+(xi-x′i)(xj-x′j)d2ν](2)其中,d=|r-r′|代表相對位置向量;E和ν分別代表各向同性的聚丙烯酰胺彈性基底的彈性模量和泊松比;δij是Kronecker符號(即當i=j時,δij=1;否則δij=0),1≤i,j≤2?？紤]到各向同性的聚丙烯酰胺彈性基底的近乎不可壓縮特性,一般可將其泊松比設(shè)為ν=0.5,這樣,積分核Gij也可以進一步簡化為:Gij(d)=34πEd[δij+(xi-x′i)(xj-x′j)d2](3)對于實際的細胞牽引力數(shù)值計算,通常將(1)式表示的連續(xù)方程進行離散化處理,即:u=GF(4)其中,細胞牽引力場為F=(F1(r′1)F2(r′1)F1(r′2)F2(r′2)…F1(r′N)F2(r′N))T,基底表面位移場為u=(u1(r1)u2(r1)u2(r2)u2(r2)…u1(rN)u2(rN))T,而基于Boussinesq基本解的離散格林函數(shù)(積分核)矩陣可以寫作:G=(G11(r1-r′1)G12(r1-r′1)G11(r1-r′2)G12(r1-r′2)?G21(r1-r′1)G22(r1-r′1)G21(r1-r′2)G22(r1-r′2)?G11(r2-r′1)G12(r2-r′1)G11(r2-r′2)G12(r2-r′2)?G21(r2-r′1)G22(r2-r′1)G21(r2-r′2)G22(r2-r′2)??????](5)注意,由于位移采樣點的個數(shù)不一定與牽引力采樣點的個數(shù)相等,因此上述矩陣G不一定為方陣。原則上,我們就可以利用(4)式根據(jù)測量得到的基底位移場求解出細胞牽引力場,但事實遠非如此。正如前面所述,由基底位移場求解細胞牽引力場的過程涉及具有奇異積分核(即Gij(d=0)=∞)的第一類Fredholm積分方程,屬于高度病態(tài)的反問題范疇。積分核Gij在(1)式等號右端的積分過程中通常起著光滑的作用,這種光滑作用的結(jié)果實際上常常丟失信息,而逆運算(即由測量得到的位移場求解細胞牽引力場)卻很難直接還原這些丟失的信息,這將導致細胞牽引力場的求解計算結(jié)果極其不穩(wěn)定。在通過公式(1)和(4)直接反求細胞牽引力場過程中,輸入位移數(shù)據(jù)的微小波動或誤差都極有可能引起反演結(jié)果的巨大波動。為了盡可能準確地重建細胞牽引力場,必須根據(jù)當前問題的特點,尋找一些先驗的知識來最大限度地恢復(fù)丟失的信息,從而獲得比較可靠的反演結(jié)果。2.2dw方法的模型一般來說,處理病態(tài)反問題的通常辦法是采用所謂的正則化(也稱規(guī)整化,Regularization)。正則化的目的就是修改一個病態(tài)問題成為一個良態(tài)問題,使得問題的解在物理上是合理的,并且連續(xù)地依賴于數(shù)據(jù)。當然,對問題的任何一種修改都必須是合理的,必須符合人們對于問題的解的先驗知識。事實上,所謂正則化,其基本思想就是利用關(guān)于解的先驗知識,構(gòu)造附加約束或改變求解策略,使得反問題的解變得確定和穩(wěn)定。由于物理問題的多樣性以及人們對于先驗知識的了解和利用方面的差異,不同的問題和不同的研究者往往會構(gòu)建不同的反演方法。對于細胞牽引力反演而言,目前主要存在如下幾種方法:(1)DW方法。DW方法是由Dembo和Wang在1999年首先提出的,有的文獻中也稱此方法為邊界元法(BoundaryElementMethod,BEM)。DW方法出現(xiàn)早期,這一方法把細胞與彈性基底接觸區(qū)域劃分為網(wǎng)格,假設(shè)細胞牽引力以集中力的形式分別作用在這些網(wǎng)格的節(jié)點上,然后通過位移場來反演相應(yīng)的細胞牽引力場。由于位移采樣點的總數(shù)(這里用m表示)一般多于網(wǎng)格節(jié)點上的細胞牽引力采樣點的總數(shù)(這里用n表示),因此,表征牽引力與基底位移場之間關(guān)系的離散格林函數(shù)系數(shù)矩陣為非方陣,這使得直接通過系數(shù)矩陣求逆的方法求得細胞牽引力場的思路變得行不通。另一方面,由于基于集中力假設(shè)的Boussinesq解生成的格林函數(shù)具有奇異性,這樣得到的DW方程是具有弱奇異核的第一類Fredholm積分方程,這類方程一般來說是高度病態(tài)的。針對這些問題,Dembo和Wang采用著名的Tikhonov正則化方法(TikhonovRegularization)[39,40,41,48,49,50]來提高細胞牽引力反演結(jié)果的穩(wěn)定可靠性。此時,正則化參數(shù)λ可基于使下面的表達式達到最小值來確定:χ2+λΙ2(6)其中χ2代表χ2統(tǒng)計,即:χ2=m∑i=1(di-n∑j=1G(rij)Fj)2σ2i(7)上式中,di代表聚丙烯酰胺彈性基底表面第i個熒光粒子的位移測量值大小;σi代表di的誤差;G(rij)是基于集中力假設(shè)的Boussinesq解的離散格林函數(shù)矩陣;Fj代表第j個網(wǎng)格節(jié)點上的細胞牽引力分量。I2是與網(wǎng)格劃分有關(guān)的約束項,其具體取值比較復(fù)雜,有興趣的讀者可以參考文獻。DW方法試圖通過先驗的信息來提高反演結(jié)果的可靠性,但操作過程十分復(fù)雜,不利于數(shù)據(jù)的實時處理;由于只假設(shè)細胞牽引力僅在網(wǎng)格的節(jié)點上存在,不同的網(wǎng)格劃分將直接導致這些細胞牽引力作用點位置發(fā)生變化,這說明DW方法具有一定的“主觀性”,細胞牽引力反演結(jié)果將因此受到影響。另外,DW方法在確定約束項I2時假設(shè)細胞牽引力場分布是光滑的,這與實際情況也有較大差別。(2)TRPF方法。TRPF(Tractionreconstructionwithpointforces)方法(基于集中力假設(shè)的細胞牽引力反演方法)是Schwarz等人在2002年首先提出的。該方法假設(shè)在細胞與基底的每個粘附位置(粘著斑)上受到集中力的作用,由于在集中力作用點處經(jīng)典Boussinesq解呈現(xiàn)奇異性,因此,這種方法要求位移采樣點與集中力的作用點位移必須分開一段距離,TRPF方法中的格林函數(shù)矩陣一般具有較大的條件數(shù),集中力假設(shè)導致的牽引力反演病態(tài)問題較嚴重。為了提高反演結(jié)果的可靠性,TRPF方法采用零階Tikhonov正則化方法,即:minF{|GF-u|2+λ20|F|2}(8)上式中,G是基于集中力假設(shè)的Boussinesq解的離散格林函數(shù)矩陣;F和u分別代表細胞牽引力場和彈性基底表面位移場;λ0是零階正則化參數(shù)。一般來說,此正則化參數(shù)的選取十分關(guān)鍵,否則得到的反演結(jié)果會很糟糕。TRPF方法采用L曲線法來確定λ0的取值,需要指出的是,L曲線法需要專門的曲線拐角識別算法(Corner-findingAlgorithm)來確定最優(yōu)的正則化參數(shù),這在一定程度上降低了TRPF方法的反演效率。另外,使用TRPF方法求解細胞牽引力場時,一般將單個粘著斑位置處的牽引力作用點人為地選在其幾何中心處,因此,反演前必須事先準確知道粘著斑分布的位置,否則由此帶來的誤差將會對細胞牽引力反演造成很大影響。(3)基于Boussinesq積分解的牽引力反演方法。細胞主要經(jīng)由粘著斑對細胞外基質(zhì)(彈性基底)施加力。Balaban等人的生物學實驗表明,作用在粘著斑上的切向力大小與粘著斑的面積近似成正比,這一事實顯示單個粘著斑上所受的牽引力呈現(xiàn)均勻分布的特點。根據(jù)上述實驗結(jié)果并考慮到以往基于集中力Boussinesq基本解對于細胞牽引力反演的一些弊端,本文作者提出了基于分布力的Boussinesq積分解來代替基于集中力的Boussinesq基本解進行細胞牽引力反演計算。其基本思路是把細胞下面的彈性基底劃分為矩形網(wǎng)格(作為采樣柵格),并假設(shè)每個矩形網(wǎng)格上的細胞牽引力呈均勻分布,如圖3所示。設(shè)矩形網(wǎng)格單元的長和寬分別為2l和2b,其上作用有切向均布牽引力,強度用p表示,局部坐標原點O選擇在此矩形單元的幾何中心位置,則這個網(wǎng)格單元上均勻分布的牽引力引起彈性基底表面上任意一點(x,y)位置處的彈性變形可以表示為如下的積分形式(即把經(jīng)典的Boussinesq基本解在此矩形區(qū)域上進行積分):{u(x,y)=∫b-b∫l-lp(1+ν)2πER{1+(x-ξ)2R2+(1-2ν)[RR+z-(x-ξ)2(R+z)2]}dξdηv(x,y)=∫b-b∫l-lp(1+ν)(x-ξ)(y-η)2πER[1R2-1-2ν(R+z)2]dξdη(9)經(jīng)過一系列較復(fù)雜繁瑣的數(shù)學積分運算,可以得到如下的解析表達式:u(x,y)=p(1+ν)2πE(2×((b-y)×log((l-x)+R1(-l-x)+R3)-(-b-y)×log((l-x)+R2(-l-x)+R4))+(l-x)×log((b-y)+R1(-b-y)+R2)-(-l-x)×log((b-y)+R3(-b-y)+R4)+(1-2ν)×((l-x)×log((b-y)+R1(-b-y)+R2)-(-l-x)×log((b-y)+R3(-b-y)+R4)))(10)v(x,y)=pν(1+ν)πE(-R1+R2+R3-R4)(11)其中,R1=√(l-x)2+(b-y)2,R2=√(l-x)2+(b+y)2?R3=√(l+x)2+(b-y)2,R4=√(l+x)2+(b+y)2。應(yīng)該指出,上述基于矩形分布力的Boussinesq積分解消除了經(jīng)典Boussinesq基本解在集中力作用點位置處的奇異性。為了構(gòu)建新的離散格林函數(shù)矩陣,我們設(shè)牽引力為單位強度(p=1),基底泊松比ν=0.5(聚丙烯酰胺基底),這樣,以上兩式可進一步化簡為:?u(x,y)=34πE(2×((b-y)×log((l-x)+R1(-l-x)+R3)-(-b-y)×log((l-x)+R2(-l-x)+R4))+(l-x)×log((b-y)+R1(-b-y)+R2)-(-l-x)×log((b-y)+R3(-b-y)+R4))(12)?v(x,y)=34πE(-R1+R2+R3-R4)(13)由此,可以得到新的基于矩形分布力Boussinesq積分解的離散格林函數(shù)矩陣:[gij]=[g11g12g21g22]=[?u(x,y)-?v(y,-x)?v(x,y)?u(y,-x)](14)這樣,細胞牽引力場和基底表面位移場之間的對應(yīng)關(guān)系可重新數(shù)值離散為如下形式:u=gΤ(15)其中,位移場為u=(u1(r1)u2(r1)u1(r2)u2(r2)?u1(rΝ)u2(rΝ))Τ,切向的細胞牽引力場為Τ=(Τ1(r′1)Τ2(r′1)Τ1(r′2)Τ2(r′2)?Τ1(r′Ν)Τ2(r′Ν))Τ?Ν代表采樣點總數(shù),而此時系數(shù)矩陣為(2N×2N)階方陣,即:g=(g11(r1-r′1)g12(r1-r′1)g11(r1-r′2)g12(r1-r′2)?g21(r1-r′1)g22(r1-r′1)g21(r1-r′2)g22(r1-r′2)?g11(r2-r′1)g12(r2-r′1)g11(r2-r′2)g12(r2-r′2)?g21(r2-r′1)g22(r2-r′1)g21(r2-r′2)g22(r2-r′2)??????]2Ν×2Ν(16)最后,基于矩形分布力Boussinesq積分解的細胞牽引力場可以通過下式求解:Τ=g-1u(17)對于這種基于矩形分布力Boussinesq積分解的細胞牽引力反演算法而言,采樣網(wǎng)格單元的實際尺寸一般可以達到(1～2μm)×(1～2μm),這與粘著斑的短軸尺寸(1～2μm)大致相當。此時,離散格林函數(shù)矩陣g的2范數(shù)下的條件數(shù)一般不會超過102量級,反演過程中位移噪聲的放大效應(yīng)會被顯著抑制,牽引力的計算結(jié)果比較穩(wěn)定可靠。在這種情況下,可以不必進行復(fù)雜的正則化處理,反演計算得以大大簡化,這對于發(fā)展具有實時處理功能的高效牽引力顯微分析系統(tǒng)是至關(guān)重要的。然而需要說明的是,當矩形采樣單元尺寸進一步減小時,此問題所涉及到的病態(tài)效應(yīng)將開始顯現(xiàn),此方法對噪聲的抑制能力開始減弱,反演的可靠性將會降低。因此,運用如上所述反演方法時,我們推薦使用的采樣單元實際尺寸為(1～2μm)×(1～2μm)。(4)FTTC方法。FTTC是Fouriertransformtractioncytometry的英文縮寫(基于傅立葉變換的細胞牽引力反演方法),這一細胞牽引力反演方法是由Butler等人在2002年首先提出的。他們當時注意到表征細胞牽引力與基底表面位移之間關(guān)系的第一類Fredholm積分方程(即公式(1))可等效地寫作如下的卷積形式:→u(r)=G(r)?→Τ(r)(18)其中位移向量用u→(r)=(ux(r),uy(r))Τ表示,而相應(yīng)的牽引力向量用Τ→(r)=(Τx(r),Τy(r))Τ表示(注:在(1)式中牽引力(集中力)用符號F(r)代表,而(15)和(18)式中的牽引力(分布力)用符號T(r)代表);G(r)是基于集中力Boussinesq基本解的格林函數(shù)(積分核),其分量形式如公式(2)和(3)所示。對(18)式兩端作二維傅里葉變換并運用卷積定理可知:u→?(k→)=G?(k→)Τ→?(k→)(19)上式兩邊左乘G?-1,然后在進行傅里葉逆變換,則有:Τ→(r)=FΤ2-1(G?(k→)-1u→?(k→)(20)G(k→)=G(kx,ky)=A2πk3[(1-ν)k2+νky2-νkxky-νkxky(1-ν)k2+νkx2](21)其中,A=(1+ν)πE?k=|k→|=kx2+ky2。另外,由于波向量的零點(kx,ky)=(0,0)對應(yīng)于空間域中的剛體位移部分,與基底的彈性變形(位移場)無關(guān),因此FTTC方法通常不計算這一波數(shù)處的細胞牽引力分量,即直接令Τ→(0)=0。FTTC方法把細胞牽引力反演變換到Fourier空間來實現(xiàn),這樣,通過對不同波數(shù)位置處的位移分量與相應(yīng)的系數(shù)矩陣直接相乘,就可獲得這一波數(shù)處的牽引力分量。由于在傅立葉空間中力與位移不存在耦合關(guān)系,因此,FTTC方法將極大地節(jié)省數(shù)據(jù)存儲空間。另一方面,FTTC方法可利用成熟的快速傅立葉變換(FFT)技術(shù)來提高求解計算速度,易于進行高效牽引力反演運算。與此同時,也應(yīng)該指出,在上述FTTC方法中,由于輸入的位移場不具有嚴格的周期性,往往在牽引力場的邊界會產(chǎn)生頻率混疊效應(yīng),但這些僅在圖像視場邊界處出現(xiàn),一般不會影響細胞位置處的粘附力反演效果(因為通常細胞總是在遠離圖像邊界的中心位置)。FTTC方法通過傅立葉變換的方式有效地避免了基于集中力的Boussinesq基本解的奇異性問題,但是,在解卷積過程中依然存在病態(tài)的問題,嚴格的理論和數(shù)值分析表明,較稀疏采樣網(wǎng)格的情況下(例如20～30個像素),即其對應(yīng)的奈奎斯特采樣頻率與位移場的頻譜大致相當時,FTTC方法不會表現(xiàn)出反演病態(tài)現(xiàn)象,具有較好的穩(wěn)定性。但是當采用網(wǎng)格進一步增加時,FTTC方法會出嚴重的病態(tài),對高頻噪聲異常敏感,牽引力反演結(jié)果極不可靠。(5)基于二維傅里葉空間最優(yōu)濾波的牽引力反演方法。上述經(jīng)典FTTC方法首次實現(xiàn)了在傅立葉空間求解細胞牽引力場,但這一方法的一個致命弱點在于沒有充分考慮到反卷積的病態(tài)問題,因此,它用于細胞牽引力反演存在很大風險,特別是在位移場信噪比比較低的情況下,其反演獲得的牽引力場往往被噪聲嚴重“污染”,反演精度顯著降低,甚至得不到可靠的牽引力反演結(jié)果。為此,本文作者基于經(jīng)典FTTC方法,發(fā)展了一整套基于二維傅立葉空間最優(yōu)濾波的細胞牽引力反演方法。考慮到測量得到的位移場含有噪聲,即:u^→(x,y)=u→(x,y)+n→(x,y)(22)或?qū)懽鞣至啃问?[u^x(x,y)u^y(x,y)]=[ux(x,y)uy(x,y)]+[nx(x,y)ny(x,y)](23)其中,u^→(x,y)=[u^x(x,y)u^y(x,y))]Τ代表測量得到的含噪聲位移場(例如通過DIC方法得到的彈性基底表面位移場);u→(x,y)=[ux(x,y)uy(x,y)]Τ表示無噪聲的真實位移場;n^→(x,y)=[nx(x,y)ny(x,y)]Τ代表加性白噪聲。對(22)式進行二維傅立葉變換,則有:u^→(kx,ky)=u→(kx,ky)+n→(kx,ky)(24)其分量形式可以等效地表示為:[u^x(kx,ky)u^y(kx,ky)]=[ux(kx,ky)uy(kx,ky)]+[nx(kx,ky)ny(kx,ky)](25)另一方面,在經(jīng)典的FTTC方法中,由于沒有考慮位移場噪聲的影響,所以根據(jù)(20)式可知:Τ→(k→)=G?(k→)-1u→(k→)(26)即在沒有噪聲(或不考慮噪聲)的情況下,其分量形式可以表示為:{Τx(k→)=R11(k→)ux(k→)+R12(k→)uy(k→)Τy(k→)=R21(k→)ux(k→)+R22(k→)uy(k→)(27)注,在上式中我們已經(jīng)事先設(shè)R(k→)=G?(k→)-1,即:[R11(kx,ky)R12(kx,ky)R21(kx,ky)R22(kx,ky)]2×2=(A2πk3[(1-ν)k2+νky2-νkxky-νkxky(1-ν)k2+νkx2])-1(28)對于實際含有噪聲的位移場(即(24)式),可以通過類比(27)式,構(gòu)造出帶有最優(yōu)(Wiener)濾波參數(shù)的細胞牽引力表達式,即:{Τ^x(k→)=R11(k→)u^x(k→)Φxx(k→)+R12(k→)u^y(k→)Φxy(k→)Τ^y(k→)=R21(k→)u^x(k→)Φyx(k→)+R22(k→)u^y(k→)Φyy(k→)(29)其中,Φxx(k→),Φxy(k→),Φyx(k→),Φyy(k→)分別為實最優(yōu)濾波參數(shù)。接下來,我們期望選取適當?shù)纳鲜鰹V波參數(shù),使求得的牽引力Τ→^(如公式(29)所示)在最小均方差意義下盡可能地接近真實細胞牽引力場Τ→(盡管如公式(27)所示的真實牽引力場Τ→總是未知的),即要求下面的表達式取得最小值:∫-∞+∞|Τ→^(r→)-Τ→(r→)|2dr→=∫-∞+∞∫-∞+∞|Τ→^(x,y)-Τ→(x,y)|2dxdy=∫-∞+∞∫-∞+∞|Τ