分子生物學(xué)檢測(cè)及動(dòng)物試驗(yàn)

第七節(jié)分子生物學(xué)檢測(cè)一、細(xì)菌DNA由四個(gè)堿基組成：鳥嘌呤（G）腺嘌呤（A）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）嚴(yán)格的堿基配對(duì)：A＝TG＝C常以G＋C堿基對(duì)的摩爾百分比來測(cè)定細(xì)菌DNA四個(gè)堿基對(duì)的含量來鑒定細(xì)菌。二、細(xì)菌DNA提取過程(一)細(xì)菌的培養(yǎng)及細(xì)菌收集細(xì)菌培養(yǎng)：液體培養(yǎng)，固體培養(yǎng)細(xì)菌收集：一般要求收集2-3克濕菌體(二)細(xì)菌破壁1.超聲波破壁法2.氧化鋁磨碎法3.反復(fù)凍融法4.化學(xué)試劑破壁法，十二烷基磺酸鈉“SDS”5.溶菌酶溶解法6.其他方法：細(xì)菌研磨法、玻璃珠研磨法。三、細(xì)菌DNA的提取方法(一)Marmur氯仿提取法濕菌體2~3克離心洗滌一次懸浮于30~35ml250g/L的SDS于60℃加熱10分鐘，使之破裂加入5mol/LNaCl(終濃度為1mol/L)置入帶塞的玻璃溶器中，加入等體積的氯仿-異戊醇(24:1v/v)5000~10000r/min離心5min分層0.1mol/LNaCl50ml溶液0.1mol/LEDTApH8.0溶液冷卻到室溫后振蕩20min上層水相含核酸中層蛋白質(zhì)下層氯仿-異戊醇吸出上層含核酸的水相加入二倍體積的乙醇用攪拌棒攪拌用棒卷出絲狀DNA，靠壁擠干再充分溶于10~15ml0.1SSC(0.15mol/LNaCl~0.15mol/L檸檬酸三鈉)Ph7.0±0.2簡(jiǎn)稱SSC稀釋10倍為0.1SSC待全部溶解，再用10SSC(1SSC濃縮10倍)調(diào)整到約1SSC的濃度再與等體積的氯仿-異戊醇一起振蕩15min重復(fù)一次進(jìn)行清除蛋白，直到看不見變性蛋白為止注意：1.被溶解的細(xì)菌濃度不能太低。2.SDS為陰離子去污劑，各廠家、批號(hào)、等級(jí)差異較大。3.離心分層后，取水相液體要準(zhǔn)確。(二)細(xì)菌DNA中G+C摩爾百分比測(cè)定1.化學(xué)方法用電泳和層析等技術(shù)2.物理方法用熱變性溫度(目前常用方法)G+C摩爾百分比測(cè)定，是細(xì)菌分類鑒定的一種重要方法。缺點(diǎn)：不能表達(dá)出DNA堿基的排列順序。核酸雜交技術(shù)核酸雜交技術(shù)（techniqueofnucleicacidhybridization）是由現(xiàn)代分子生物學(xué)的重要方法之一。是用特定標(biāo)記的已知核酸序列與待測(cè)核酸進(jìn)行特異性的雜交結(jié)合，形成雜交體，并利用相應(yīng)的顯示技術(shù)來檢測(cè)目標(biāo)核酸的存在及其位置的分子生物學(xué)方法。一、核酸探針(DNA探針)就是指帶有標(biāo)記物的，能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知核酸序列片段。(一)核酸探針的種類根據(jù)標(biāo)記方法放射性探針非放射性探針根據(jù)核酸性質(zhì)DNA探針CDNA探針RNA探針寡核苷酸探針1.NDA探針DNA探針是目前最常用的核酸探針，因具有三大優(yōu)點(diǎn)：這類探針克隆在質(zhì)粒載體上，可無限繁殖，取之不盡；DNA探針與RNA探針相比，不易降解，一般能抑制DNA酶活性；DNA探針標(biāo)記方法較成熟，制備方法簡(jiǎn)便。

DNA探針一般長(zhǎng)度在幾百堿基對(duì)，可以是雙鏈DNA，也可是單鏈DNA；可以是某一基因的全部序列，也可是部分序列。2.CDNA探針CDNA是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子(complementaryDNA)，CDNA是由RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，這種DNA探針不含有內(nèi)含子序列，尤其適用基因表達(dá)檢測(cè)。3.RNA探針是一類很有前途的核酸探針，常用細(xì)胞mRNA和病毒RNA，具有高雜交效率。但易降解，標(biāo)記復(fù)雜之缺點(diǎn)。4.寡核苷酸探針根據(jù)某一特殊核酸序列，選擇其中最穩(wěn)定區(qū)域，經(jīng)人工合成，為18~30個(gè)堿基，能識(shí)別一個(gè)堿基。具有以下特點(diǎn)：由于鏈短，序列復(fù)雜度低，分子量小，雜交耗時(shí)短；一次性可合成大量寡核苷酸探針；短探針，堿基錯(cuò)配能降低雜交體的Tm值。二、標(biāo)記物32P半衰期14.3d35S半衰期87.1d14C半衰期125I半衰期60d

三、基因重組載體載體的功能是將一個(gè)外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞具體的條件1.其本身是復(fù)制子，能自我復(fù)制。2.分子量小，帶有選擇標(biāo)記。3.對(duì)幾種限制性內(nèi)切酶有單一切點(diǎn)。4.并有一定非必要區(qū)，允許外源基因插入。Southern印跡雜交兩個(gè)主要過程：一是將待測(cè)核酸分子通過一定方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物上(即印跡，blotting)。二是固定于膜上的核酸同標(biāo)記的探針在一定溫度和離子強(qiáng)度下退火(復(fù)性)即分子雜交過程。一、待測(cè)核酸樣品的制備病毒感染的細(xì)胞組織或分泌物提取DNA酚/氯仿抽取法用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA0.1~1μg待切DNA適當(dāng)限制性內(nèi)切酶緩沖液20~50ul用滅菌Eppendorf管置合適溫度下保溫一個(gè)小時(shí)，加入EDTA65℃加熱滅活限制性內(nèi)切酶樣品DNA二、瓊脂糖凝膠電泳分離待測(cè)DNADNA樣品0.3~3%瓊脂糖凝膠在一定電場(chǎng)下進(jìn)行電泳1~3h得到很多DNA條帶將電泳凝膠浸泡在0.25mol/L的HCl溶液短暫的脫嘌呤處理移到堿性溶液(0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl)在用中性pH的緩沖液(0.5mol/LTris-HClpH7.51.5mol/LNaCl)使DNA變性并斷裂形成較短的單鏈DNA片段中和凝膠中的緩沖液在20×SSC中平衡凝膠10min保持單鏈狀態(tài)DNA片段，易于同探針雜交三、轉(zhuǎn)膜將凝膠中的單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上(硝酸纖維膜)(必須保持凝膠電泳時(shí)區(qū)帶位置不變)四、雜交(一)預(yù)雜交DNA片段與探針進(jìn)行雜交前必須先進(jìn)行預(yù)雜交，因能結(jié)合DNA片段的膜，同樣能結(jié)合探針DNA，所以須將膜上所有能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)全部封閉。(二)正式雜交五、放射性自顯影用放射性同位素標(biāo)記dNTP（2’-單脫氧核苷酸），測(cè)定核酸序列是應(yīng)用最早。放射性試劑a-32p有強(qiáng)放射性和散射性，少用a-35S標(biāo)記dATP，高自顯影條帶分辨率Northern印跡雜交

(Northernblotting)一、原理：是將RNA樣品通過瓊脂凝膠電泳進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用帶標(biāo)記物的探針對(duì)固相膜上的RNA進(jìn)行雜交，常用于RNA病毒核酸的檢測(cè)。二、步驟1.RNA樣品提取氯化鋰—尿素法熱酚法PolgA+的寡聚dT纖維素親和法2.電泳分離：甲醛瓊脂糖凝膠電泳3.轉(zhuǎn)移和紫外線交聯(lián):將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜后，用波長(zhǎng)254nm，600μw/cm2，紫外線燈下，曝光5min，取出尼龍膜置80℃，烘烤60min后尼龍膜即可雜交。4.雜交與結(jié)果檢測(cè)原位雜交是用特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針，與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，此雜交能保持細(xì)胞的完整性，但能對(duì)細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行定性、定位測(cè)定。臨床標(biāo)本組織切片經(jīng)甲醛溶液固定經(jīng)石蠟包埋將標(biāo)本片和組織片上加入探針如果是細(xì)菌菌落,稱菌落原位雜交如果是細(xì)胞,稱組織原位雜交斑點(diǎn)雜交硝酸纖維素膜具有吸附單鏈DNA或RNA的特性，可將樣品直接點(diǎn)在樣品膜上，經(jīng)變性，固定后進(jìn)行雜交，稱斑點(diǎn)雜交(dotblothybridization)。免疫印跡法(immunoblot)免疫印跡法，也稱免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)。1975年southern首先用于分析核酸，故稱核酸印跡，southernblot。1977年Alwine將此法用RNA研究，取名Northernblot1979年Towbin，又?jǐn)U展到蛋白分析，又稱蛋白印跡。其后，Burnetle則名之為Westernblot，以后Gershou改稱為immunoblot。1982年Reinhart將此方法中轉(zhuǎn)移電泳一步省去，而采用直接吸印法，因而把該法改良后，又稱Easternblot基本原理：是將凝膠電泳與固相免疫測(cè)定兩種方法結(jié)合起來的一種技術(shù)。方法步驟：1.將抗原物質(zhì)(蛋白質(zhì)、多糖)通過聚苯烯酰胺凝膠電泳分離。2.將電泳分離的組分轉(zhuǎn)移到固相基質(zhì)上(硝酸纖維素濾紙)。3.轉(zhuǎn)移后的組分進(jìn)行免疫法測(cè)定。應(yīng)用范圍：1.病原體抗原的鑒定與分析，篩選尋找特異性抗原。2.抗體的鑒定與分析，分析患者對(duì)不同抗原組分的抗體應(yīng)答狀態(tài)，目前用于艾滋病的診斷。3.免疫復(fù)合物的分析。一、基本原理：是一種在體外模擬天然DNA復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增技術(shù)，但反應(yīng)體系較為簡(jiǎn)單。包括變性-復(fù)性-延伸三步循環(huán)反應(yīng)。(1)變性：通過加熱(95℃)使雙鏈DNA解開成單鏈DNA。(2)退火(引物粘合)：當(dāng)溫度突然降低時(shí)(55℃)，濃度很高的引物與其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈，以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3’-OH末端。聚合酶鏈反應(yīng)PCR（3）聚合(引物延伸)：在Taq-DNA聚合酶、4種dNTP及Mg2+存在的條件下，聚合酶催化引物在3’端不斷延伸，在模板DNA鏈上形成新鏈，從而使模板DNA擴(kuò)增1倍。（4）在DNA聚酶作用下，引物擴(kuò)增延伸，每經(jīng)過變性、復(fù)性、延伸一個(gè)循環(huán)，模板DNA增加一倍，而新合成的DNA又作為下一循環(huán)的模板，經(jīng)過25-30個(gè)循環(huán)后原DNA量增加至106-109倍（拷貝）引物的要求：▲長(zhǎng)度在15-30bP▲G+C含量應(yīng)在45-55%之間▲堿基分布均勻，避免連續(xù)出現(xiàn)4個(gè)以上▲

自身無互補(bǔ)序列▲兩個(gè)引物之間同源堿基小于4個(gè)以上三步構(gòu)成一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一次循環(huán)反應(yīng)的模板，大約經(jīng)25-30次循環(huán)反應(yīng)，可使特異性DNA片段擴(kuò)增100萬倍(2小時(shí))。（1）兩種引物：為保證DNA聚合酶能夠?qū)蓷l互補(bǔ)鏈均能進(jìn)行延伸，需要兩種引物，分別位于兩條互補(bǔ)DNA鏈的3’-端。引物決定了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及其特異性，引物設(shè)計(jì)及合成的優(yōu)劣直接涉及有效擴(kuò)增能否成功，引物設(shè)計(jì)應(yīng)考慮下述原則:

①引物長(zhǎng)度：15—30個(gè)堿基為宜，引物過短會(huì)使特異性降低，引物越長(zhǎng)，擴(kuò)增的特異性越好，但敏感性相應(yīng)下降。

②G+C含量：在40%-60%為宜，引物Tm值可用公式計(jì)算：Tm=4（G+C）+2（A+T）

③堿基分布的隨機(jī)性。應(yīng)盡量避免具有多聚嘌呤或嘧啶核苷酸的序列，尤其3’端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。

④引物自身：不應(yīng)該存在互補(bǔ)序列，連續(xù)互補(bǔ)堿基不能多于3bp，否則引物自身會(huì)折疊形成發(fā)夾狀二級(jí)結(jié)構(gòu)。

⑤兩個(gè)引物之間不應(yīng)該有多于4個(gè)的互補(bǔ)或同源堿基，尤其應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊，以防形成二聚體。

⑥引物的3’端：引物的3’端是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板DNA配對(duì)，不能進(jìn)行任何修飾，也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能。引物的3’端最佳堿基選擇是G和C，因?yàn)樗鼈冃纬傻膲A基配對(duì)比較穩(wěn)定。

⑦引物的5’端：引物的5’端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，因此可以被修飾。引物的5’端的修飾包括加酶切位點(diǎn)，標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等，引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列，引入突變位點(diǎn)等。⑧引物的特異性：引物與非特異性擴(kuò)增序列的同源性不要超過90%或有8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。(2)耐熱Taq-DNA聚合酶（Taq酶）：這是在耐熱細(xì)菌體內(nèi)提取的一種DNA聚合酶，可保證在95℃，30分鐘以上不會(huì)變性失活。0.5-5U/100μL。(3)四種脫氧核糖核苷酸：用作底物的dNTPs。20-200μM。(4)緩沖溶液：保證DNA聚合酶催化時(shí)所需的適當(dāng)?shù)娜芤簆H值。10-50mmol/LTris-HCl(室溫pH8.3-8.8,72℃pH7.2)。(5)Mg2+：是Taq-DNA聚合酶活性所必需。加入量比dNTPs濃度高0.5-2.5mmol/L。三.反應(yīng)條件

(1)溫度和時(shí)間變性:95℃,30S；退火：45℃-55℃，30S-1min；延伸：72℃，<1kb延伸1min,3-4kb需3-4min(2)循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)取決于模板DNA的濃度,理論上循環(huán)225次后,PCR產(chǎn)物的累積即達(dá)最大值,但實(shí)際操作中,每步反應(yīng)不可能達(dá)100%效率,一般按75%計(jì)算25-30次比較合理,循環(huán)次數(shù)太少,產(chǎn)物的量不多,循環(huán)次數(shù)過多,會(huì)導(dǎo)致PCR反應(yīng)”平臺(tái)效應(yīng)”的出現(xiàn)。

擴(kuò)增產(chǎn)物分析

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凝膠電泳分析法

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斑點(diǎn)雜交分析法

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酶譜分析法根據(jù)酶切位置

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序列分析法四、PCR技術(shù)的特點(diǎn)1.高度的敏感性PCR產(chǎn)物的生成是以指數(shù)方式增加的，它可對(duì)單拷貝基因、單個(gè)細(xì)胞、單根頭發(fā)、一滴血等微量標(biāo)本進(jìn)行分析。2.高度的特異性在PCR實(shí)驗(yàn)中，只要引物設(shè)計(jì)合理，反應(yīng)溫度適宜（>50~55℃），其擴(kuò)增的特異性是很高的。其它因素如：酶濃度、dNTP、Mg2+、pH等對(duì)PCR的忠實(shí)性也有一定的影響。

3.操作簡(jiǎn)便、迅速已有多種類型的PCR擴(kuò)增儀，只需把反應(yīng)材料按一定的比例混合，置于儀器內(nèi)，反應(yīng)便會(huì)按