植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)內(nèi)蒙古科技大學(xué)數(shù)理與生物工程學(xué)院2010年4月目錄實(shí)驗(yàn)一培養(yǎng)器皿的洗滌與環(huán)境的消毒及培養(yǎng)基母液的配制實(shí)驗(yàn)二植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基配制、分裝與滅菌實(shí)驗(yàn)三番茄子葉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)四馬鈴薯莖段的擴(kuò)繁培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)五海棠葉片的離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)六胡蘿卜離體根的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)七組織培養(yǎng)物的繼代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)八馬鈴薯脫毒與組培快繁實(shí)驗(yàn)九沙棘組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及實(shí)施實(shí)驗(yàn)一培養(yǎng)器皿的洗滌與環(huán)境的消毒及培養(yǎng)基母液的配制常用組織培養(yǎng)的玻璃容器及接種用的玻璃器皿如錐形瓶、培養(yǎng)皿、試管、配置培養(yǎng)基用的試劑瓶、燒杯等以及金屬的鑷子、剪刀、接種鏟等，用前必須經(jīng)過(guò)洗滌，有的還要消毒。一器皿的洗滌方法一般玻璃器皿，特別是第一次使用的新的玻璃器皿，首先用清水充分浸泡后用堿水刷洗，然后用清水充分除去堿液，再用無(wú)離子水或蒸餾水刷洗干凈后烘十或晾十，待用。檢查玻璃器皿是否洗刷干凈的標(biāo)準(zhǔn)是：洗后的玻璃器皿沾水后，布滿于整個(gè)玻璃表面并形成完整的水膜，而不會(huì)有不均勻的水珠出現(xiàn)。當(dāng)玻璃器皿十分骯臟，帶有不同的污漬時(shí)，則需要特殊的洗滌液浸泡4-12小時(shí)，然后再用清水漂洗干凈，較常用的是銘酸洗液，它是用重銘酸鉀加入濃硫酸配制而成，其腐蝕性極強(qiáng)，對(duì)衣物、皮膚等均十分有害，一般盡量避免使用。目前生產(chǎn)有各種合成的化學(xué)洗滌劑，可清除各種污物，使用方便，是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常用的。金屬用具在第一次使用前必需先用四氯化碳或乙醚等有機(jī)溶劑將其表面的防銹油擦洗干凈，用布擦十方可使用，每次使用后需用水清洗并保持干燥。二器皿及環(huán)境的消毒方法器皿的消毒方法分為：物理方法又可細(xì)分為：十熱消毒法(Dryheatsterilization):適用于玻璃器皿、金屬和一些不怕高溫的物品，如培養(yǎng)皿、錐形瓶、各種試劑瓶、刀、剪、鑷子等。一般在150°C烘箱內(nèi)烤2-3小時(shí)，在消毒滅菌前將所要消毒的物品包裝于固定容器或耐熱的包裝材料內(nèi)(如飯盒、培養(yǎng)皿滅菌筒、鋁箔紙等)，防止在使用前的再次污染。濕熱消毒法(Wetheatsterilization)：不能用干熱消毒的物品，如配置好的培養(yǎng)基、易燃的棉花、工作服、口罩等，要使用高壓滅菌鍋，通過(guò)水蒸氣壓達(dá)到滅菌消毒的目的，常用氣壓為15磅或1.2kg/cm2，溫度為121-124C，滅菌20分鐘即可達(dá)到殺滅細(xì)菌、消毒的目的。超濾消毒法(Ultrafiltratesterilization)：不耐熱易在高溫下分解破壞的藥品如某些酶類，某些具有生物活性的物質(zhì)，如椰乳、抗菌素等，高熱常使之失效，常用超濾膜或微孔濾膜過(guò)濾，將細(xì)菌等污染源除去后方可使用，常用0.45pm孔徑的或0.63pm和0.45pm孔徑合用，可將最小的細(xì)菌除掉，一般細(xì)菌的大小為1pm左右。紫外光燈消毒法(Ultravioletirradiation):因消毒效果較弱，要較長(zhǎng)時(shí)間照射方可達(dá)到消毒效果，因此只作輔助方法，如一個(gè)1.2x1.2x2.4m2的小接種間需照射2-3小時(shí)。2.化學(xué)消毒方法(Chemicalsterilizationmethods)常用于桌面、臺(tái)面、房間的消毒，如用70%的酒精或異丙醇擦拭工作臺(tái)面，或用新潔爾滅(一種表面活性殺菌劑)噴灑消毒，或用丙二醇(或甲醛及高錳酸鉀)熏蒸房間等。實(shí)驗(yàn)二培養(yǎng)基母液的配制植物在自然狀態(tài)下生長(zhǎng)時(shí)，具有完整的營(yíng)養(yǎng)體，是屬于自養(yǎng)型的，很多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以自制，對(duì)外界營(yíng)養(yǎng)條件的要求比較簡(jiǎn)單，而在離體條件下生長(zhǎng)的植物器官、組織和整體植物不同，屬于異養(yǎng)型，要求的營(yíng)養(yǎng)條件十分復(fù)雜，因此在人工合成培養(yǎng)基的組成和制備上必須全面考慮，滿足供應(yīng)。一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐渲婆囵B(yǎng)基母液是植物組織培養(yǎng)的基本技術(shù)。當(dāng)需要連續(xù)和大量配制培養(yǎng)基時(shí)，如果每次都稱量藥品、溶解并定容，工作將十分繁瑣，因此需要將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物質(zhì)、激素類分別配制成適當(dāng)?shù)臐饪s液。要求掌握植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基母液的配制方法。二、 實(shí)驗(yàn)材料儀器冰箱、電子天平（0.0001g）容量瓶：1000ml,500ml、250ml、100ml、25ml廣口儲(chǔ)液瓶：500ml、250ml、50ml、25ml燒杯：1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml數(shù)十根玻璃攪棒、大藥勺、小藥勺標(biāo)簽紙、膠水、記號(hào)筆藥品50%酒精、95%酒精、1N鹽酸（1N鹽酸（HCl）的配制：取濃鹽^2.5ml，加入蒸餾水1000ml，即為1N的HCl）、1NNaOH（1N氫氧化鈉（或氫氧化鉀）的配制：稱40gNaOH（或氫氧化鉀57.1g）加入蒸餾水1000ml，即為1N的NaOH（1N的KOH）幾種常用的培養(yǎng)基所需的大量元素、微量元素、有機(jī)物、激素、鐵鹽等藥品、蒸餾水三、 實(shí)驗(yàn)步驟按照培養(yǎng)基配方，把大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、植物激素分類，每一類中各種藥品分別稱量。如MS培養(yǎng)基各種母液的配制步驟如下：1、大量元素母液：包括用量較大的幾種化合物，按表中排列順序，將每種藥品的用量擴(kuò)大10倍，分別稱取，分別溶解，然后按照順序混合在一起。如鈣鹽等易發(fā)生沉淀的藥品不能混合，應(yīng)單位定容。最后加上蒸餾水，定容至1升或500毫升。在定容時(shí)注意用蒸餾水洗凈燒杯和玻璃棒以減少誤差。定容后的溶液為大量元素母液，配制培養(yǎng)基時(shí)，每配1L培養(yǎng)基需吸取該母液100ml或50ml。2、 微量元素母液：因用量少，為了稱量精確和方便，常配成100倍或1000倍的母液，即每種藥品擴(kuò)大100倍或者1000倍。逐個(gè)溶解，混合在一起成為微量元素母液，每配1L虬6培養(yǎng)基需吸取該母液10ml或者1ml。3、 鐵鹽：在培養(yǎng)基配制中需要單獨(dú)配制，它是由硫酸亞鐵（FeSO47H20）5.57g和乙二氨四乙酸二鈉（Na2-EDTA）7.45g，分別溶解，混合后，用酒精燈加熱半小時(shí)以上，冷卻后定容至1L。冰箱過(guò)夜貯藏?zé)o結(jié)晶析出，否則重新配制。每配l升培養(yǎng)基需加該鐵鹽母液5ml。4、 有機(jī)物質(zhì)：主要指氨基酸，維生素類物質(zhì)。它們大都是擴(kuò)大1000倍，分別稱量，分別定容和儲(chǔ)存，配制培養(yǎng)基時(shí)按需要的量加入。5、 植物激素：常用的有生長(zhǎng)素類如：2,4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）；細(xì)胞分裂素類：激動(dòng)素（KT）、6-芐基氨基嘌吟（6-BA）、玉米素（ZT）。配制時(shí)需要單個(gè)稱量，根據(jù)需要可分別用酸、堿或酒精等不同的溶劑溶解后，再用蒸餾水配制成所需的濃度，一般為每毫升含0.1-2mg/ml，配制培養(yǎng)基時(shí)按所需要的量分別加入，如2,4-D和6-BA常配成1mg/ml的母液。在配制2,4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）母液時(shí)，先用幾滴95%酒精溶解完全后，加蒸餾水定容，否則會(huì)發(fā)生沉淀。而激動(dòng)素（KT）、6-芐基氨基嘌吟（6-BA）、玉米素（ZT）母液時(shí)，要用少量的1mol/LHCl或NaOH溶解，最后加水定容。配好的母液要標(biāo)記好配制的日期以及藥物的濃度。

表1MS培養(yǎng)基配方藥品名稱規(guī)定用量(g)擴(kuò)大倍數(shù)稱取量(g)母液定容體積/mlMSI(大量元素,包括N、P、K、S、Ca、Mg)NH4NO31.6510X16.51000kno31.919CaCl2.2H2O0.44(若無(wú)水:0.332克)4.4MgSO4.7H2O0.373.7KH2PO40.171.7MSII(微量元素,包括B、Mn、Cu、Zn、Mo、Co、I、Cl)KI0.0001661000x0.166200H3BO40.001241.24MnSO4.H2O0.004464.46ZnSO4.7H2O0.001721.72Na2MoO4.2H2O0.000050.05CuSO4.5H2O0.0000050.005CoCl2.6H2O0.0000050.005Fe鹽(MSW)Na2.EDTA.2H2O0.03725200x1.49200FeSO4.7H2O0.027851.114msm(有機(jī))煙酸(VB2)0.0005100x0.01200鹽酸毗哆醇(VB6)0.00050.01鹽酸硫胺素(VB1)0.00010.002甘氨酸0.0020.04肌醇肌醇0.1200x2200

表2N6朱全清(1970)培養(yǎng)基配方藥品名配方量(mg/L)母液倍數(shù)稱取量(g/L)(NH4)2SO4大量兀素46310X4.63KNO3283028.3CaCl2?2H2O1661.66MgSO4?7H2O1851.85KH2PO44004.0Na2-EDTA鐵鹽37.3100X3.73FeSO4.7H2O27.82.78MnSO4?4H2O二主微量?jī)核?.01000X4.0ZnSO4?7H2O3.83.8H3BO31.61.6KI0.80.8鹽酸硫胺素(VB1)有機(jī)物質(zhì)11000X1.0煙酸0.50.5鹽酸毗哆醇(VB6)0.50.5甘氨酸2.02.0藥品名稱母液倍數(shù)稱取量（g/L）KNO3-US.大量兀素（1000ml）10X30（NH4）2SO41.34CaCl21.133NaH2PO4.H2O1.5MgSO4.7H2O5肌醇有機(jī)物質(zhì)（250ml）100X2.5鹽酸硫胺素（VB1）0.25鹽酸毗哆醇（VB6）0.025煙酸（VPP）0.025MnSO4.4H2O微量?jī)核兀?50ml）100X0.25H3BO30.070ZnSO4.7H2O0.05Na2MoO4.2H2O0.00625CuSO4.5H2O0.000625CoCl2.6H2O0.000625KI0.01870各種母液配制好后，要貼好標(biāo)簽，注明母液的名稱，配制1匚培養(yǎng)基需要的吸取量、母液配制的日期，然后放入冰箱中儲(chǔ)存。一般無(wú)機(jī)物質(zhì)的母液在冰箱中可保存半年以上，有機(jī)物質(zhì)的母液保存時(shí)間在半年以內(nèi)，但若發(fā)現(xiàn)有沉淀或霉變，應(yīng)立即重新配制。三、注意事項(xiàng)1.藥品的質(zhì)量問(wèn)題：為了避免雜質(zhì)及有害物質(zhì)對(duì)組織培養(yǎng)的影響，必須注意藥品質(zhì)量。國(guó)內(nèi)藥品采用國(guó)際上通用標(biāo)準(zhǔn)，分為：一級(jí)，即保證試劑、優(yōu)質(zhì)純?cè)噭〨uaranteedReagent,GR級(jí)；二級(jí)，即分析純?cè)噭?，AnalyticalReagent,AR級(jí)；三級(jí)，即化學(xué)純?cè)噭?，ChemicalPure,CP級(jí)；四級(jí)，即實(shí)驗(yàn)試劑，LaboratoryReagent,LR級(jí)。各級(jí)均有一定的雜質(zhì)含量限制范圍，其它特殊用的試劑也有特殊的標(biāo)記，如光譜純、層析用、組織培養(yǎng)用等。植物組織培養(yǎng)一般用分析純級(jí)試劑。如藥品所帶結(jié)品水不同，應(yīng)進(jìn)行換算。例：在配制10XMS大量元素入溶液時(shí)，需要稱量CaCl2.2H2O為4.4克，現(xiàn)只有無(wú)水CaCl2,請(qǐng)問(wèn)需要稱量多少克？計(jì)算方法為：4.4XCaCl2/CaCl2.2H2O=4.4x(40+2x35.5)/(40+2x35.5)+2x18=3.3g稱量必需準(zhǔn)確，一般用1/萬(wàn)?4/萬(wàn)的分析天平稱量，特別如微量元素及激素等，但有些藥品不影響基本反應(yīng)過(guò)程的如蔗糖、瓊脂等可用1/100粗天平稱取。所用的水必須純凈，一般用全玻璃蒸餾器二次蒸餾的重蒸水或者達(dá)到一定標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)離子水。制備好的濃縮液應(yīng)保存于冰箱中，儲(chǔ)備液配置量要依據(jù)使用頻度而定，一般所制備的儲(chǔ)備液最好于1-2個(gè)月內(nèi)使用完，不宜過(guò)長(zhǎng)時(shí)間保存。實(shí)驗(yàn)三植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基配制、分裝與滅菌一、 儀器設(shè)備及試劑電磁爐天平(0.0001g)高壓滅菌鍋量筒：10ml、20ml、100ml、500ml燒杯：1000ml、500ml、250ml移液管：1ml、2ml、5ml吸管若干、記號(hào)筆三角瓶或試管、試管架錫鉑紙、玻璃棒配制好的各種母液，如大量元素母液、微量元素母液、鐵鹽、有機(jī)物、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等，個(gè)別生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑要隨配隨用。蒸餾水、pH試紙蔗糖、瓊脂等1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液。二、 方法和步驟量取所配培養(yǎng)基總體積的2/3體積的蒸餾水，如要配l升培養(yǎng)基，先量取約700ml體積的水。根據(jù)培養(yǎng)基配方，用量筒量取所需要的各種元素的母液。物質(zhì)加入體積或重量大量元素母液(10x)100ml微量元素母液(1000x)1ml有機(jī)物質(zhì)母液(200x)5ml鐵鹽母液(200x)5ml肌醇(200x)5ml蔗糖30g瓊脂7g吸取母液時(shí)，注意應(yīng)先將幾種母液按順序排好，不要弄錯(cuò)以免使培養(yǎng)基中藥品成分發(fā)生改變。在培養(yǎng)不同的外植體時(shí)，應(yīng)加入不同的激素，如培養(yǎng)康乃馨側(cè)芽或莖段時(shí)加入1ml的1mg/ml的6.B4；而胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中應(yīng)加入2ml的1mg/ml的2,4刀。加入一種母液后應(yīng)先攪拌均勻，避免因不均而使局部濃度過(guò)高而引起沉淀，瓊脂可在加入蔗糖調(diào)節(jié)完pH值后再加入，此時(shí)應(yīng)注意攪拌，以免瓊脂或蔗糖沉淀于燒杯底而炭化。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，用pH計(jì)或pH試紙測(cè)定培養(yǎng)基的pH按照培養(yǎng)材料的要求分別用1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液來(lái)調(diào)節(jié)所配制培養(yǎng)基的pH值，一般培養(yǎng)基的pH值約為5.8,培養(yǎng)的材料不同，對(duì)培養(yǎng)基的pH值要求也不同。分裝加熱至沸騰片刻，以使瓊脂充分溶解，檢查時(shí)可注意燒杯內(nèi)溶液是否透明。將配制并加熱好的培養(yǎng)基分別裝在事先洗凈的三角瓶，用封口膜封口，注明標(biāo)簽，然后和用牛皮紙或報(bào)紙包好的培養(yǎng)皿及用三角瓶裝好的蒸餾水一道進(jìn)行高壓滅菌。培養(yǎng)基的滅菌一般用醫(yī)用高壓鍋來(lái)滅菌（方法略），本實(shí)驗(yàn)采用全自動(dòng)高壓滅菌鍋。培養(yǎng)基的保存消毒過(guò)的培養(yǎng)基通常放在接種室或培養(yǎng)室中保存，一般應(yīng)在消毒后的兩周內(nèi)用完，最好不要超過(guò)一個(gè)月。三、注意事項(xiàng)激素應(yīng)在調(diào)節(jié)pH之前加入，因?yàn)橛行┘に厥怯盟峄驂A溶解的，在調(diào)節(jié)pH好之后加入會(huì)改變pH值。pH過(guò)酸或過(guò)堿對(duì)培養(yǎng)基均是不利的，會(huì)導(dǎo)致過(guò)軟或過(guò)硬的結(jié)果，從而影響培養(yǎng)質(zhì)量。在本次實(shí)驗(yàn)中將下次實(shí)驗(yàn)所需的其它材料一同滅菌處理。實(shí)驗(yàn)三番茄子葉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)改良番茄性狀已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一，作為植物轉(zhuǎn)基因工作的基礎(chǔ)，番茄愈傷組織誘導(dǎo)至關(guān)重要，它是遺傳轉(zhuǎn)化成功的前提和保障。一、 材料和設(shè)備超凈工作臺(tái)培養(yǎng)基：（1）種子萌發(fā)培養(yǎng)基1/2MS（2）愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+IAA0.5+6-BA2.0帶有吸水紙的成套的培養(yǎng)皿，無(wú)菌水解剖刀、槍型鑷子、刀片消毒劑0.1%的升汞溶液70%酒精、95%酒精及70%的酒精棉球1000毫升的玻璃燒杯數(shù)個(gè)、酒精燈、火柴、記號(hào)筆二、 實(shí)驗(yàn)材料番茄種子三、 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)材料的處理番茄種子于70%的酒精中浸泡1min，無(wú)菌水沖洗1次，再用0.3%NaC1O溶液浸泡20min，用無(wú)菌水沖洗5-6次，接種到1/2MS培養(yǎng)基上。接種取下培養(yǎng)瓶的塞子（或錫鉑紙），用火灼燒瓶口2cm處，手持培養(yǎng)瓶呈45°角，用消毒鑷子把4-8個(gè)種子播種于不含任何激素的IS固體培養(yǎng)基的表面，然后立即將燒過(guò)的封口棉塞或錫鉑紙封住瓶口。每?jī)纱无D(zhuǎn)移之間都要用酒精燈灼燒鑷子，防止帶菌。接種到1/2MS培養(yǎng)基上，溫箱中于28°C培養(yǎng)7天后2片子葉完全展開(kāi)。在無(wú)菌條件下，剪取無(wú)菌苗的子葉切成5mmx5mm的小塊，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，約3周長(zhǎng)出淡綠色、結(jié)構(gòu)致密的愈傷組織。接種后在培養(yǎng)瓶上標(biāo)明培養(yǎng)物名稱和培養(yǎng)日期。四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告結(jié)果及觀察。培養(yǎng)幾天后外植體表面開(kāi)始變得粗糙，有許多光亮點(diǎn)出現(xiàn)，這是愈傷組織開(kāi)始形成的癥狀。在數(shù)周培養(yǎng)后，將長(zhǎng)大的愈傷組織切成小塊轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，用放大鏡觀察愈傷組織表面特征。作業(yè)。寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)馬鈴薯莖段的擴(kuò)繁培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)馬鈴薯莖段的擴(kuò)繁培養(yǎng)一、 意義馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是茄科茄屬一年生草本植物。其塊莖可供食用，是重要的糧食、蔬菜兼用作物。在生長(zhǎng)期間馬鈴薯容易受病毒侵染，病毒一旦侵入，表現(xiàn)出各種各樣的退化類型。在生產(chǎn)中，主要是利用莖尖分生組織的脫毒培養(yǎng)以提高馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。馬鈴薯莖段快繁、培育壯苗和誘導(dǎo)試管薯是馬鈴薯脫毒生產(chǎn)的重要的環(huán)節(jié)，這些環(huán)節(jié)的研究對(duì)于優(yōu)化整個(gè)莖尖脫毒體系有重要的意義。二、 儀器設(shè)備和試劑儀器設(shè)備超凈工作臺(tái)、帶有吸水紙的成套的培養(yǎng)皿，剪刀、鑷子、封口膜、酒精燈、小刷子、量筒、濾紙。試劑70%乙醇、0.1%升汞、無(wú)菌水、培養(yǎng)基MS三、實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)過(guò)催芽的馬鈴薯塊莖四、 方法和步驟外植體滅菌：從已催出芽(芽長(zhǎng)一般2-4cm)的干凈健康馬鈴薯塊莖上掰下芽，用自來(lái)水沖洗干凈，先放入70%乙醇中消毒30s，再用0.1%的升汞溶液中浸泡8-10min，放入無(wú)菌水中浸泡6次，每次5min，然后接種到MS基本培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)瓶中接種1-5個(gè)外植體。接種：先進(jìn)行無(wú)菌室內(nèi)消毒，用紫外燈照射30-45分鐘，地面用低濃度的來(lái)蘇爾溶液消毒，紫外燈關(guān)閉約20分鐘后方可進(jìn)去工作。超凈工作臺(tái)消毒：開(kāi)啟無(wú)菌風(fēng)開(kāi)關(guān)，讓無(wú)菌風(fēng)吹上30-45分鐘后方可工作。并用70%的酒精棉球擦凈工作臺(tái)。接種時(shí)先點(diǎn)燃酒精燈，鑷子和剪刀都要先浸泡在70%的酒精溶液中。用酒精燈上灼燒好冷卻后的鑷子、剪刀取出一個(gè)側(cè)芽或小段莖，迅速打開(kāi)三角瓶口，將材料才插入瓶?jī)?nèi)，注意材料上下端的極性，不能倒插。在酒精燈邊蓋上封口膜，用記號(hào)筆在瓶體上寫(xiě)明日期和材料。3.培養(yǎng)條件：25°C光照13小時(shí)/天，光強(qiáng)1000Lx。實(shí)驗(yàn)五麗格海棠葉片的離體培養(yǎng)麗格海棠（BegoniaelatiOr又稱玫瑰海棠，屬秋海棠科秋海棠屬的多年生草本花卉。因其花色艷美、花型多樣、花朵碩大、花期特長(zhǎng)，尤其是在春節(jié)開(kāi)花，深受市場(chǎng)的歡迎。目前，最好的麗格海棠盆花仍以進(jìn)口為主，但由于麗格海棠不耐運(yùn)輸，長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸不僅使麗格海棠折斷受損情況普遍發(fā)生，而且對(duì)葉片的形狀、花的形態(tài)也會(huì)造成很大的影響，導(dǎo)致觀賞效果的嚴(yán)重下降；同時(shí)，麗格海棠存在生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，抗病性差和栽培難度大等問(wèn)題，因此，在國(guó)內(nèi)對(duì)麗格海棠進(jìn)行品種的遺傳改良，加強(qiáng)其繁殖和栽培技術(shù)的研究已迫在眉睫。它可以用打插、分枝和嫁接繁殖，但是麗格海棠的分枝能力弱，莖段打插成活率低，繁殖速度緩慢無(wú)法滿足市場(chǎng)需要，有必要進(jìn)行組織培養(yǎng)研究。二、 儀器設(shè)備和試劑儀器設(shè)備超凈工作臺(tái)、帶有吸水紙的成套的培養(yǎng)皿，剪刀、鑷子、封口膜、酒精燈、小刷子、量筒、濾紙。試劑95%乙醇、75%乙醇、75%酒精棉球、0.1%升汞、無(wú)菌水、蒸餾水、培養(yǎng)基MS格BA5NM5L三、 實(shí)驗(yàn)材料麗格海棠幼嫩葉片四、 方法和步驟1外植體滅菌：取麗格海棠幼嫩葉片，自來(lái)水沖洗30-60分鐘，剪成1cm2大的小塊兒，然后在無(wú)菌室（超凈工作臺(tái)）內(nèi)用75%酒精浸沒(méi)20秒鐘。用0.1%的升汞溶液浸泡10-15分鐘，再用無(wú)菌水沖洗3-4次，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中的濾紙上待用。2接種：先進(jìn)行無(wú)菌室內(nèi)消毒，用紫外燈照射30-45分鐘，地面用低濃度的來(lái)蘇爾溶液消毒，紫外燈關(guān)閉約20分鐘后方可進(jìn)去工作。超凈工作臺(tái)消毒開(kāi)啟無(wú)菌風(fēng)開(kāi)關(guān)，讓無(wú)菌風(fēng)吹上30-45分鐘后方可工作。并用75%的酒精棉球擦凈工作臺(tái)。接種時(shí)先點(diǎn)燃酒精燈，鑷子和剪刀都要先浸泡在75%的酒精溶液中。用酒精燈上灼燒好冷卻后的鑷子、剪刀取出一個(gè)葉塊，迅速打開(kāi)三角瓶口，將材料放到瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基上，一般葉片上表面在上。在酒精燈邊蓋上封口膜，用記號(hào)筆在瓶體上寫(xiě)明日期和材料。3培養(yǎng)條件：25°C光照13小時(shí)/天，光強(qiáng)1000Lx。實(shí)驗(yàn)六胡蘿卜離體根的培養(yǎng)、目的要求胡蘿卜是細(xì)胞和組織培養(yǎng)中的經(jīng)典材料且其來(lái)源方便，是實(shí)驗(yàn)教學(xué)的良好材料，本實(shí)驗(yàn)的目的是學(xué)習(xí)胡蘿卜離體根培養(yǎng)的基本方法和步驟，學(xué)會(huì)和掌握愈傷組織誘導(dǎo)的基本技術(shù)。二、材料、儀器與試劑材料：市售大而新鮮的胡蘿卜。儀器：超凈工作臺(tái)（或無(wú)菌箱）、滅菌鍋、顯微鏡、解剖刀、刮皮刀、不銹鋼打孔器、長(zhǎng)把鑷子、燒杯、培養(yǎng)皿、移液管等。試劑：（1）MS培養(yǎng)基，并附加1mg/L2,4-D和2mg/L6-BA;（2）消毒劑。70%酒精和0.1%升汞溶液三、實(shí)驗(yàn)步驟1.將胡蘿卜用自來(lái)水沖洗干凈，用刮皮刀除去表皮1-2cm，橫切成大約10mm厚的切片。2.胡蘿卜片經(jīng)70%酒精處理15秒后，無(wú)菌水沖洗一遍，再用0.1%升汞溶液浸泡6-8min，無(wú)菌水沖洗3-4次。將胡蘿卜片平放入培養(yǎng)皿中，一手用鑷子固定胡蘿卜片，一手用打孔器按平行于組織片垂直軸方向打孔。每個(gè)小孔應(yīng)打在靠近微觀形成層的區(qū)域，務(wù)必打穿組織。然后從組織片中抽出打孔器，用玻璃棒輕輕將圓柱體從打孔器中推出，收集在裝有無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中。重復(fù)打孔步驟直至制備足夠數(shù)量的組織圓柱體。4、用鑷子取出圓柱體，放入培養(yǎng)皿中，用刀片切除圓柱體兩端各2mm長(zhǎng)的組織。將剩下的組織切成3個(gè)各約2mm厚的小圓片，將制備好的小圓片轉(zhuǎn)移到裝有無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中。用鑷子將圓片轉(zhuǎn)到滅菌的濾紙上，將圓片兩面的水分吸十，并立即植到培養(yǎng)基表面。將培養(yǎng)物置于25°C溫箱中培養(yǎng)，可同時(shí)將一部分放到光下培養(yǎng)，比較光下和暗處對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的反應(yīng)。四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告結(jié)果及觀察。培養(yǎng)幾天后外植體表面開(kāi)始變得粗糙，有許多光亮點(diǎn)出現(xiàn)，這是愈傷組織開(kāi)始形成的癥狀。在數(shù)周培養(yǎng)后，將長(zhǎng)大的愈傷組織切成小塊轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，用放大鏡觀察愈傷組織表面特征。作業(yè)。寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)七組織培養(yǎng)物的繼代培養(yǎng)一、 材料和設(shè)備材料：從培養(yǎng)4-6周的外植體上長(zhǎng)出的愈傷組織、叢生芽或胚狀體超凈工作臺(tái)培養(yǎng)基：不同的實(shí)驗(yàn)材料培養(yǎng)基不同三角瓶、帶有吸水紙的成套的培養(yǎng)皿、鑷子、解剖刀70%酒精、95%酒精及70%的酒精棉球酒精燈、火柴、記號(hào)筆二、 方法步驟.取材在無(wú)菌室的超凈工作臺(tái)內(nèi)，每次取一瓶培養(yǎng)物，灼燒培養(yǎng)瓶口約20毫米處，用灼燒冷卻后的鑷子和解剖刀，取出外植體或者愈傷組織放在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中。每個(gè)培養(yǎng)皿中約放4-6個(gè)外植體或者愈傷組織。把每塊愈傷組織分成兩、三個(gè)不小于5mm見(jiàn)方的小塊。外植體下面向著中心的細(xì)胞常呈壞死狀，不適宜作繼代培養(yǎng)。這些壞死的部分應(yīng)當(dāng)與正常的部分分離并棄去。每次操作后要去掉用過(guò)的吸水紙并重新蓋上培養(yǎng)皿的蓋子。.繼代轉(zhuǎn)接將正在發(fā)育的外植體或愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上，接種方法同前。轉(zhuǎn)接后在培養(yǎng)瓶上寫(xiě)明培養(yǎng)物、培養(yǎng)基、日期。長(zhǎng)期培養(yǎng)的胡蘿卜組織會(huì)產(chǎn)生大塊愈傷組織。正在發(fā)育的愈傷組織作第一次繼代培養(yǎng)所用的實(shí)驗(yàn)程序與以后每隔四周轉(zhuǎn)移一次建成愈傷組織系的繼代培養(yǎng)程序相同。.實(shí)驗(yàn)記錄將實(shí)驗(yàn)記錄抄錄于筆記本上，注明實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的日期、持續(xù)期、培養(yǎng)物的數(shù)目、污染數(shù)目和所作的不同處理。在四星期內(nèi)，每隔一星期用肉眼觀察培養(yǎng)物，記錄培養(yǎng)物形態(tài)的變化，培養(yǎng)物的生長(zhǎng)狀態(tài)、鮮重變化等，必要時(shí)作拍照記錄。實(shí)驗(yàn)八馬鈴薯莖尖的脫毒培養(yǎng)馬鈴薯是世界四大農(nóng)作物之一，但作為寒地作物，在溫暖地區(qū)種植容易感染病毒而退化，不能就地留種。而且馬鈴薯屬于無(wú)性生殖，以塊莖做種，每畝需要125公斤的塊莖種薯。這些特性使馬鈴薯留種調(diào)種成為世界難題?！拔⑿兔摱痉N薯快速繁殖技術(shù)”成功地解決了大種薯微型化問(wèn)題，而且縮短了生長(zhǎng)周期。同時(shí)，這種優(yōu)質(zhì)種薯克服了大種薯用量大、運(yùn)輸不便等缺點(diǎn)，而且健康無(wú)毒，具有很好的豐產(chǎn)性。一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆振R鈴薯脫毒培養(yǎng)的過(guò)程。二、 實(shí)驗(yàn)材料馬鈴薯芽、接種器皿與用具、MS液體培養(yǎng)基、生長(zhǎng)素、分裂素等。莖尖培養(yǎng)基：（1L）TOC\o"1-5"\h\zMS大量母液 100mLMS有機(jī) 10mL肌醇 10mL鐵 5mLMS微量 1mL蔗糖 30g生長(zhǎng)素：6-BA，半胱氨酸，赤霉素，IAA各1mL。擴(kuò)繁培養(yǎng)基：（1L）MS大量母液 100mLMS有機(jī) 10mL肌醇 10mL鐵 5mLMS微量 1mL蔗糖 30g產(chǎn)種薯培養(yǎng)基：（1L）MS大量母液 100mLMS有機(jī) 10mL肌醇 10mL鐵 5mLMS微量 1mL蔗糖 80g加香豆素（或矮壯素）50mg,6-BA5mg,光照時(shí)間不得多于8小時(shí)，時(shí)間為2個(gè)月。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一） 材料預(yù)處理用1%的洗衣粉將土豆表面的泥土洗掉，再用清水沖洗數(shù)遍，室溫下放置在陰暗處使之生芽，若需其快速生芽，可用0.1mg/L的赤霉素處理。（二） 剝莖尖將芽從土豆上掰下放入瓶中，瓶口處蓋上紗布用自來(lái)水沖洗半個(gè)小時(shí)，將其取出放入0.1%的升汞中浸泡10分鐘，之后放入無(wú)菌水，待剝。剝莖尖的過(guò)程需在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。首先將解剖鏡擺放好，放上滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)皿上放上滅過(guò)菌的濾紙，將處理好的芽放在濾紙上，用解剖針由外向內(nèi)逐層剝?nèi)デo尖外的葉片（莖尖的大小與脫毒情況成正比，所剝莖尖越小，脫毒越徹底，但不太易于成活，一般莖尖大小0.1-0.88mm，至少帶1個(gè)葉原基）。將剝好的莖尖接入培養(yǎng)基上，盡量放在中間部位，靠近管壁處不易生長(zhǎng)。一般培養(yǎng)4-6周才能成苗。也可以直接用苗進(jìn)行脫毒將選出的瓶苗，用新潔爾滅噴一下之后，放入超凈工作臺(tái)上，打開(kāi)封口膜，選擇含莖尖的部位，用鑷子取下，放在解剖鏡下剝莖尖。（三） 切段快繁接種：將試管內(nèi)的成苗切成數(shù)段，放入三角瓶中（使用的是擴(kuò)繁培養(yǎng)基），只要含一個(gè)節(jié)間即可，一般14天左右即可成苗。注意：要順著生長(zhǎng)方向插入培養(yǎng)基中，易于生長(zhǎng)。擴(kuò)繁：將接種兩周后的苗，用解剖剪切成數(shù)段，放入裝有培養(yǎng)基的三角瓶中。染菌苗處理：將染菌的上端切下，放入升汞中浸泡5分鐘后，取出用無(wú)菌水洗一下，放入新的培養(yǎng)基中。（四） 培養(yǎng)條件：21?25°C、2000-3000lx、12h/d。（五） 2-3周愈傷組織形成，4-5周綠點(diǎn)出現(xiàn)，3-6月長(zhǎng)成2-3cm小芽，越慢越好，出芽很快的扔掉。（六） 培養(yǎng)成功的馬鈴薯脫毒苗，經(jīng)ELISA（試劑盒）或PCR鑒定。四、 結(jié)果與分析1、 愈傷組織形成數(shù)目、綠點(diǎn)形成數(shù)目。2、 脫毒苗的鑒定結(jié)果。3、 切段培養(yǎng)的結(jié)果。4、 污染程度與原因分析。五、 提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。綜合實(shí)驗(yàn)沙棘組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及實(shí)施實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.熟悉利用組織培養(yǎng)的方法擴(kuò)培沙棘了解組織培養(yǎng)過(guò)程中需要注意的事項(xiàng)與步驟掌握組培實(shí)驗(yàn)中涉及的實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)原理：沙棘為胡頹子科沙棘屬，是一種落葉性灌木，其特性是耐旱，抗風(fēng)沙，可以在鹽堿化土地上生存，因此被廣泛用于水土保持。國(guó)內(nèi)分布于華北、西北、西南等地