臨床科研基本方法

臨床科研基本方法學(xué)習(xí)篇一、提高心智生活水平

（自我教育能力）

從哲學(xué)觀點來說，所謂心智生活水平包括二個方面：

心靈生活——“心靈愉悅”，表示學(xué)習(xí)知識的樂趣心智生活

智力生活——“智力快樂”，表示運用智力的樂趣東西方文化差異——父親給孩子打傘方式二、科研意識培養(yǎng)科研機遇平等，結(jié)果不同！善于對事物的細(xì)微觀察好奇性

學(xué)—問—思—辨—行！三、培養(yǎng)強烈的創(chuàng)新意識——民族生存的靈魂，國家興旺的源泉！——個人事業(yè)不斷進(jìn)取的關(guān)鍵四、培養(yǎng)創(chuàng)新科研意識

——創(chuàng)新貫徹科研活動的始終

設(shè)計創(chuàng)新方法理論成果藝術(shù)包裝營銷方式、渠道管理體制

創(chuàng)新性是一切科研工作的生命，是科學(xué)發(fā)展的動力

臨床科研的創(chuàng)新性、科學(xué)性與求異思維（一）創(chuàng)新的本質(zhì)

在人類物質(zhì)文明、精神文明的一切領(lǐng)域，一切層面上能先于他人，見人所未見，思人所未思，行人所未行，從而獲得人類文明的新發(fā)展、新突破。

（二）創(chuàng)新的思想源泉

是求異思維，敏于生疑，敢于存疑，勇于質(zhì)疑。由此就能不斷地產(chǎn)生新異的、多彩的、多元的發(fā)展性、創(chuàng)新性、突破性的新構(gòu)思、新思想、新思維。（三）科學(xué)的本質(zhì)

是人類世世代代以每個人的有限認(rèn)識能力，去探究無限的外界客觀存在和客觀規(guī)律的一個永無止境的過程?？茖W(xué)又總是后人不斷發(fā)現(xiàn)前人認(rèn)識中的缺陷、不足、錯誤，并予以修正、補充，乃至推翻其中某些錯誤結(jié)論而前進(jìn)、而發(fā)展的。（四）科學(xué)精神的內(nèi)涵包含五大要素：客觀的依據(jù)理性的懷疑多元的思考平權(quán)的爭論實踐的檢驗

“疑”字是核心，是關(guān)鍵。理性的懷疑，不疑不會有異，無異不會有新。只有：生疑→存疑→質(zhì)疑，才能有新發(fā)現(xiàn)，新發(fā)明。求異思維從孩童期培養(yǎng)。五、科學(xué)精神，“疑”為核心客觀依據(jù)理性懷疑多元思考平權(quán)爭論實踐檢驗疑為核心敏于生疑敢于質(zhì)疑善于存疑娃娃抓起六、求異思維是創(chuàng)新源泉逆向思維異位反思自主思維排憂思維七、文化底蘊是生疑的物質(zhì)基礎(chǔ)

八、創(chuàng)新與繼承的關(guān)系創(chuàng)新是最佳的繼承繼承為了更好的創(chuàng)新緒論篇

一、醫(yī)學(xué)研究的概念

疾病健康認(rèn)識并掌握客觀規(guī)律采取增進(jìn)健康防治疾病的一切探索性措施防止促進(jìn)研究目的完成具體工作方案最大效益本專業(yè)知識、相關(guān)專業(yè)知識流行病學(xué)、生物統(tǒng)計學(xué)、社會科學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等基本原理方法理論層次邏輯層次分析綜合哲學(xué)層次歸納演繹感性認(rèn)識理性認(rèn)識最小代價臨床科研設(shè)計示意圖經(jīng)驗層次二、科研設(shè)計循證醫(yī)學(xué)與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的比較基礎(chǔ)（病理、生理）理論知識指導(dǎo)（個人）臨床經(jīng)驗基礎(chǔ)指導(dǎo)客觀（實驗）證據(jù)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)循證醫(yī)學(xué)三、循證醫(yī)學(xué)循證醫(yī)學(xué)與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的特征比較合格臨床醫(yī)生：臨床經(jīng)驗與相關(guān)技能是必要條件，但非充分條件；累積經(jīng)驗，掌握疾病機理是必要的，但未經(jīng)嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計研究的“臨床經(jīng)驗和“理論”不能作為指導(dǎo)臨床實踐的充分依據(jù)；依據(jù)病理生理學(xué)原理進(jìn)行診斷，有時可能有誤；非系統(tǒng)臨床經(jīng)驗是判斷預(yù)后、療效及評價的可靠途徑；掌握發(fā)病機制和病理生理原理足以指導(dǎo)臨床實踐；循證醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)循證醫(yī)學(xué)與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的特征比較掌握獨立準(zhǔn)確評價證據(jù)的方法，對正確認(rèn)識和引用某些文獻(xiàn)的研究結(jié)論至關(guān)重要！成本—效益是考慮診療的重要因素。熟練的技能與臨床經(jīng)驗是指導(dǎo)實踐的基礎(chǔ)，可以評價新的診療方法；較少考慮成本—效益與衛(wèi)生經(jīng)濟學(xué)。循證醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)四、臨床流行病學(xué)定義

現(xiàn)代流行病學(xué)衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)臨床醫(yī)學(xué)設(shè)計把基本原理和方法引入采用嚴(yán)密的測量醫(yī)學(xué)經(jīng)濟學(xué)研究領(lǐng)域評價醫(yī)學(xué)社會學(xué)

結(jié)局病因患者個體患者群體診斷醫(yī)學(xué)事件的從擴大到藉以探索治療等診治研究特性研究（研究）預(yù)后臨床基礎(chǔ)學(xué)科預(yù)防五、醫(yī)學(xué)科研特點

人道主義問題應(yīng)該前瞻性研究混雜因素多執(zhí)行研究的人多依從性問題標(biāo)準(zhǔn)化的處理措施不易保證多中心多層次問題宜采用序貫實驗方法（一）臨床醫(yī)學(xué)科研特點（二）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科研特點結(jié)構(gòu)與功能假設(shè)的提出機理的驗證結(jié)論的科學(xué)性（依據(jù)）結(jié)果的重復(fù)性設(shè)計的嚴(yán)密性操作的正確性樣本的代表性（三）預(yù)防醫(yī)學(xué)科研特點宏觀為主宏觀與微觀相結(jié)合調(diào)查的代表性（抽樣合理性）干預(yù)的客觀性統(tǒng)計處理恰當(dāng)結(jié)論的重復(fù)性方法的先進(jìn)性科研設(shè)計篇前言只有經(jīng)過正規(guī)科研設(shè)計才能得出正確結(jié)論1.傷寒:1880年由艾伯發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)傷寒桿菌，16年后(1896年)開始廣泛應(yīng)用，但過了66年(1962年)，才由南斯拉夫傷寒全國委員會通過現(xiàn)場(實驗)流行病學(xué)的研究方法，才作出適當(dāng)評價。2.卡介苗:1921年問世，30年后(1951年)經(jīng)現(xiàn)場評價，才作出肯定結(jié)論。3.脊灰苗:1909年發(fā)現(xiàn)病原體，45年后（1954年）其疫苗問世，經(jīng)現(xiàn)場評價，才作出肯定評價。4.百日咳:1900年發(fā)現(xiàn)病原體(痰涂片)，用甲醛滅活制成疫苗，初期的研究結(jié)論互相矛盾，46年后(1946年)經(jīng)大規(guī)模現(xiàn)場調(diào)查1萬人，嚴(yán)格分組，最終證實其效果。5.英年早逝:2006年，一位權(quán)威性的作者誤報：中關(guān)村、北大、清華科研人員的平均年齡為53歲(2004年全國普查的平均年齡為73歲)。一、科研設(shè)計的一個基本原理

基本原理

必須盡量使實驗效應(yīng)(effect)是處理因素(treatmentfactor)所引起，即:

T→e二、臨床科研設(shè)計的兩個基本原則

(一)兩組間非處理因素均衡一致原則用公式表示如下：

基本原則的公式表示T1+N1Te1+Ne1T2+N2Te2+Ne2N1=N2

T1T2:處理因素Te1Te2:

T產(chǎn)生的效應(yīng)

N1N2:非處理應(yīng)素Ne1Ne2:N產(chǎn)生的效應(yīng)例1食管癌的病因研究(病例對照研究)

居住年限病例組人數(shù)對照組人數(shù)合計10~25~30~35~>40合計1117311960138123026195113823475738111276西安市食管癌病例與對照居住年限的均衡性檢驗

χ2=4.81，P＞0.05例2新生兒黃疸是否與母親臨產(chǎn)時

使用催產(chǎn)素有關(guān)？

1972年～1986年爭論14年，6篇支持，6篇反對。臺灣婦產(chǎn)科一位學(xué)者從1986年5月～12月按下列標(biāo)準(zhǔn)從就診病人中選取206例合格病例，進(jìn)行各種條件嚴(yán)格控制的前瞻性研究。

------研究對象與研究方法1．納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)隊列研究設(shè)計應(yīng)規(guī)定明確的納入與排除研究標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：孕婦健康、胎兒足月、經(jīng)陰道生產(chǎn)，胎兒為單胎頭位，新生兒出生后至少能在嬰兒室觀察5天。排除標(biāo)準(zhǔn)：有溶血性疾病與低體重嬰兒。根據(jù)產(chǎn)婦的生產(chǎn)情況，206例分成三組:Ⅰ組：60例，完全由催產(chǎn)素導(dǎo)產(chǎn)；實際為暴露組，為暴露I組。

Ⅱ組：95例，自然生產(chǎn)加催產(chǎn)素催產(chǎn)；實際也是暴露組，為暴露II組。

Ⅲ組：51例，完全為自然產(chǎn)程，未用催產(chǎn)素，這為非暴露組。2．分組3．給藥方式

靜脈點滴給藥，用含電解質(zhì)的溶液溶解催產(chǎn)素，催產(chǎn)素濃度為5U/500ml。

------結(jié)果

三組研究對象的均衡性

作者把三個組之間可能影響研究結(jié)果的主要變量作了比較，結(jié)果表明這些影響因素在三組之間無顯著差異（P＞0.05）（表1）。

表1三組之間主要變量的比較

變量I組II組III組性別（男/女）嬰兒體重（均數(shù)，g）孕期（周）母乳喂養(yǎng)（％）Apgar記分（1min/5min）器械助產(chǎn)率（％）硬膜外麻醉地美露AFP（ng/ml）28/32322840.1608.9/9.6282212634744/51327040.9558.7/9.3352311247825/26328639.9668.8/9.533121092882.三組新生兒總血清膽紅素水平（計量資料）比較三組新生兒出生后第一、第三、第五天的總血清膽紅素，用ｔ檢驗處理，未見顯著差異（P＞0.05）（表2）。

表2三組新生兒的血清總膽紅素（10mg/dl，x±S）

時間Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組第一天第二天第三天4.9±1.59.2±2.29.9±2.85.1±1.79.1±3.09.1±3.44.9±1.49.6±2.510.0±3.33.三組新生兒高膽紅血癥比例的比較（計數(shù)資料）

如果把1次或多次的血膽紅素值≧10mg/dl作為高膽紅素血癥，則三組新生兒之間的高膽紅血癥的比例，用χ2檢驗無顯著差異。如果把這個“界線”定為≧12mg/dl或≧15mg/dl，三組之間仍然沒有統(tǒng)計學(xué)上的差異（P＞0.05）（表3）。表3三組新生兒高膽紅血癥的發(fā)生率

血清膽紅素Ⅰ組（N＝60）Ⅱ組（N＝95）Ⅲ組（N＝50）人數(shù)%人數(shù)%人數(shù)%≧10≧12≧153917364.028.03.35634359.036.03.22617352.034.06.0------結(jié)論由上述結(jié)果，作者認(rèn)為如果生產(chǎn)過程中，使用的催產(chǎn)素量不多，輸入的溶液又含有電解質(zhì)，也即如上述研究中的給藥方式，則新生兒高膽紅血癥與應(yīng)用催產(chǎn)素?zé)o關(guān)。根據(jù)設(shè)計原則提出的四種設(shè)計模式T與N四種不同關(guān)系的臨床設(shè)計方案﹡T1+N1e1+n1

﹡T2+N2e2+N2

﹡(正確)②T與N四種不同關(guān)系的臨床設(shè)計方案﹡T1+N1e1+n1﹡T2+N2e2+N2﹡(正確)③T與N四種不同關(guān)系的臨床設(shè)計方案﹡T1+N1e1+n1﹡T2+N2e2+N2

④T與N四種不同關(guān)系的臨床設(shè)計方案﹡T1+N1e1+n1

﹡T2+N2e2+N2

(二)對照、隨機、重復(fù)原則對照：是研究工作成敗之關(guān)鍵；對照組、試驗組必須保持均衡一致！可比性；是控制各種混雜因素的基本手段；正確的對照組可以平衡非處理因素對結(jié)果（e）的影響，使處理因素（T）的效應(yīng)（e）充分表現(xiàn)出來，即T→e。隨機采用隨機化原則來分組、干預(yù)，是使各組間非處理因素均衡一致的主要方法，也是實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理的基礎(chǔ)；可以減少各種主、客觀因素造成的偏倚，減少系統(tǒng)誤差，從而提高實驗的準(zhǔn)確性（即效度）；也是防止各種混雜因素的重要手段之一；隨機不等于隨意。重復(fù)按對照組和試驗組都必須要保證一定的樣本含量，以控制隨機誤差，從而提高實驗的精確度（即信度）。

?

（標(biāo)準(zhǔn)差）?x

(標(biāo)準(zhǔn)誤)=

N（樣本量）三、臨床科研設(shè)計的三要素

臨床科研一般是觀察或闡明某個或某些研究因素作用于研究對象而產(chǎn)生的效應(yīng)或影響。因此，它的主要組成必然是:

研究因素研究對象三大要素

研究效應(yīng)/影響（一）研究因素根據(jù)研究目的而施加于研究對象并能產(chǎn)生效果的因素為研究因素/處理因素。反之，與研究目的無關(guān)的其他因素都叫非處理因素（如個體特征，環(huán)境特征，氣候特征等）。

1.研究因素的內(nèi)容：

(1)外界強加于研究因素的，如生物因素、理化因素、營養(yǎng)、藥物。

(2)研究因素本身就具有的某些特征，如性別、年齡、體重。

(3)研究對象體內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生的有害因素，如遺傳、代謝、心理。

(4)醫(yī)生給予的干預(yù)因素。

2.研究因素的構(gòu)成：單因素、多因素及不同水平

3.研究因素的強度

4.研究因素的實施方法(二)研究對象研究對象：是指研究因素作用的客體。選擇研究對象是一個十分重要的問題（1）正常人，在研究某項正常人指標(biāo)或評價預(yù)防措施的效果時常用（2）病人

1.確定診斷標(biāo)準(zhǔn)，盡量采用客觀指標(biāo)。如病理學(xué)、微生物學(xué)、免預(yù)學(xué)、X線、心電圖、內(nèi)窺鏡、斷層掃描等

2.多次核實診斷

3.規(guī)定對象的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

4.確定對象的數(shù)量、分組的方法

5.對象的代表性

6.注意對象的病情，堅持采用輕癥患者的標(biāo)準(zhǔn)

7.用志愿者要慎重例1：“血管內(nèi)皮功能障礙對胰島細(xì)胞分泌功能的影響”……研究對象:

納入條件年齡：35－55歲無高血壓和糖尿病史無心、肝、腎及其他疾病

排除條件高血糖

II型糖尿病史糖耐量減低/空腹血糖異常

肥胖：按WHO1998年診斷標(biāo)準(zhǔn)：體重指數(shù)（BMI）正常<25BMI<超重/肥胖糖尿病：按WHO1990年II型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。例2：經(jīng)常吸煙——平均至少1支/日，持續(xù)>1年偶然吸煙——平均<1支/日，持續(xù)>1年戒煙——停止吸煙>

1年(三)效應(yīng)和觀察指標(biāo)效應(yīng)：是指研究因素作用于研究對象產(chǎn)生的結(jié)果，及觀察結(jié)果的指標(biāo)。1選擇指標(biāo)的條件

(1)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性

(2)指標(biāo)的客觀性，如隨機分組、采用多人盲法讀X片等

(3)指標(biāo)的準(zhǔn)確性（accuracy）、精確性（precision）即重復(fù)性

(4)指標(biāo)的靈敏性（sensitivity）

(5)指標(biāo)的特異性（specificity）

(6)指標(biāo)數(shù)量適宜，主要采用能反映效應(yīng)本質(zhì)的指標(biāo)

(7)明確各項指標(biāo)觀察的統(tǒng)一要求，如觀察方法、時間、間隔、次數(shù)、期限、記錄方法等四、臨床科研設(shè)計模式（一）臨床科研種類

1.觀察性研究（observationalstudies)2.試驗性研究(experimentalstudies)，即臨床試驗（clinicaltrials)。

3.多學(xué)科多中心研究（multiple-centerstudies）(二)臨床科研方法匯總（1）觀察性研究設(shè)計病例報告描述性研究病例分析（臨床研究初級階段）經(jīng)驗總結(jié)觀察性研橫斷面研究究設(shè)計病例對照研究分析性研究（臨床研究深入階段）

隊列研究

病例與對照不匹配成組匹配病例對照研究病例與對照匹配配對研究套式病例對照研究前瞻性

歷史性雙向性隊列研究

過去現(xiàn)在將來收集隊列隨訪

收集隊列隨訪

回顧性前瞻性

雙向性隊列研究

（2）試驗性研究設(shè)計

臨床研究的試驗性研究即臨床試驗，實際上可以把它看成是一種特殊類型的隊列研究。所不同的是研究者可以設(shè)計對照組和治療組并隨機化分組。依據(jù)設(shè)計對照組的方法不同，臨床試驗設(shè)計方案可分為六種①隨機對照實驗（RCT）

符合標(biāo)準(zhǔn)的研究對象研究對象隨機分組（合格對象）

有效試驗組(實驗措施）無效有效對照組(對照措施）無效

②隨機對照雙盲試驗（RCBT）

③交叉試驗（COD）

試驗組實驗有效 （A組）措施無效研究合格隨機對象對象分組對照組對照有效（B組）措施無效

對照組對照有效（A組）措施無效 試驗組試驗有效（B組）措施無效洗脫期

④自身前后對照試驗

有效研究合格試驗對象對象措施無效有效對照措施無效洗脫期⑤非隨機同期對照試驗

（NRCCS）和歷史對照試驗

這兩個試驗的共同點是：對照組并非由隨機化方法決定，而是依據(jù)不同的地點、不同的時間來選擇。前者是指在不同醫(yī)院間選擇，后者是指不同時期的前后對照。這些對照組的選擇常存在選擇性偏倚，兩組間的基線狀況往往不一致，從而影響結(jié)果的正確性，所以應(yīng)用受到限制。⑥序貫試驗不事先確定樣本含量；一個試驗一對受試者參加；實驗結(jié)束立即進(jìn)行結(jié)果分析；待可下結(jié)論時立即停止試驗。具體分析步驟如下：試驗前制定以下試驗標(biāo)準(zhǔn)：①有效標(biāo)準(zhǔn)SF/FS=r1=2時為有效，試驗藥可以接受（應(yīng)用）②無效標(biāo)準(zhǔn)SF/FS=r0=1時為無效，試驗藥不能接受③試驗結(jié)果的假陽性率ɑ和假陰性率β不應(yīng)>5%，即ɑ=0.05，β=0.05表1冠心寧與某對照藥對心絞痛療效的結(jié)果病歷號試驗藥對照藥結(jié)果病歷號試驗藥對照藥結(jié)果1優(yōu)差SF9優(yōu)差SF2優(yōu)差SF10優(yōu)差SF3差優(yōu)FS11優(yōu)差SF4優(yōu)差SF12優(yōu)差SF5優(yōu)差SF13優(yōu)差SF6優(yōu)差SF14優(yōu)差SF7差優(yōu)FS15優(yōu)差SF8優(yōu)差SF繪制序貫試驗邊界圖：根據(jù)試驗標(biāo)準(zhǔn)①②③可在方格坐標(biāo)紙上繪出序貫試驗邊界圖。縱坐標(biāo)Y為SF數(shù)，橫坐標(biāo)為n=SF+FS數(shù)。接受界限（上限）U：y=a+b×n拒絕界限（下限）U：y=-a+b×n（三）多學(xué)科或多中心協(xié)作研究1.多學(xué)科研究是提高研究水平的有效方法，也是現(xiàn)代研究發(fā)展方向。2.多中心研究是指在不同地區(qū)、不同單位，同時開展某一項研究，以提高研究結(jié)果的論證強度。

注意：上述兩種研究方式必須事先要嚴(yán)格統(tǒng)一研究的各項規(guī)定、方法、指標(biāo)、要求、時間等，否則，將失去意義。

南方醫(yī)科大學(xué)研究生開題論證報告書

學(xué)科專業(yè)：研究方向：課題名稱：課題來源：研究生姓名：導(dǎo)師姓名職務(wù)：研究時間：論證日期：

一、課題名稱（包括分題）二、選題依據(jù)（國內(nèi)外研究概況、水平和發(fā)

展趨勢，開展此課題研究的設(shè)想、特色或創(chuàng)新之處，主要參考文獻(xiàn)目錄和出處。

三、研究目的意義四、研究內(nèi)容指標(biāo)、技術(shù)路線及擬采取的研究方法（論述方法學(xué)的先進(jìn)性、可能性及可靠性）五、主要技術(shù)關(guān)鍵及解決途徑（包括協(xié)作要求）六、研究進(jìn)度及預(yù)期達(dá)到的指標(biāo)七、課題研究的支撐條件（具備的研究條件、估算該題的工作量及所需經(jīng)費）八、參加論證人員（姓名、職務(wù)、工作單位）九、專家論證意見（對該課題的科學(xué)性、先進(jìn)性及可行性進(jìn)行評價，提出“同意開題或不同意開題”的結(jié)論性意見）國家自然基金申請書T2DM易感基因PPARGC1分子機制及遺傳與環(huán)境交互作用的研究報告正文（一）立項依據(jù)與研究內(nèi)容（4000-8000字）1、項目的立項依據(jù)（研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析，需結(jié)合科學(xué)研究發(fā)展趨勢來論述科學(xué)意義；或結(jié)合國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中迫切需要解決的關(guān)鍵問題來論述其應(yīng)用前景。附主要參考文獻(xiàn)目錄）

研究意義

T2DM是一種由遺傳因素與環(huán)境因素聯(lián)合作用而導(dǎo)致機體以慢性高血糖為特征的一類增齡性、內(nèi)分泌、代謝異常綜合癥，為胰島素分泌不足或胰島素抵抗或兩者兼有所致。是最常見的一類慢性代謝性疾病，嚴(yán)重威脅現(xiàn)代人類的生活質(zhì)量，據(jù)WHO資料統(tǒng)計T2DM患者

近5000萬人，高居世界第二位，僅次于美國。按此計算，我國因T2DM所造成的直接經(jīng)濟損失和醫(yī)療負(fù)擔(dān)十分驚人。以上提示其對我國人民健康影響日趨嚴(yán)重。因此，預(yù)防和控制糖尿病已乘務(wù)當(dāng)今預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重要課題。然而迄今為止，糖尿病的確病因尚未充分闡明，其遺傳病因?qū)W十分復(fù)雜。為此開展我國的T2DM發(fā)生的分子機制，尋找致病易感基因。將為進(jìn)一步開展功能基因研究，從基因角度及闡明2型糖尿病的發(fā)病機制和2型糖尿病的分子診斷，為基因預(yù)測提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)；從遺傳與環(huán)境的交互作用的關(guān)系出發(fā)，探索其致病因素作用；無疑對闡明其病因及其發(fā)病機理，以至有效預(yù)防、控制、干預(yù)和治療糖尿病的發(fā)生發(fā)展都具有重要的意義。學(xué)術(shù)價值：

近年，隨著分子生物學(xué)理論及技術(shù)的發(fā)展，尤其是人類基因組計劃研究迅速進(jìn)展和突破、基因定位技術(shù)經(jīng)驗的積累及統(tǒng)計分析方法的進(jìn)步，使得2型糖尿病的分子遺傳學(xué)研究有了長足進(jìn)展。闡明參與2型糖尿病的易感基因種類、特征及機制是2型糖尿病分子遺傳學(xué)研究的目標(biāo)之一。目前比較常用的是采用候選基因的功能區(qū)或非功能區(qū)多態(tài)標(biāo)記進(jìn)行群體關(guān)聯(lián)分析，或是采用隨機DNA位點或候選基因的高雜合度非功能區(qū)多態(tài)標(biāo)記進(jìn)行家系分析。2型糖尿病受到遺傳基因與環(huán)境條件的雙重調(diào)控。不同遺傳背景的人群糖尿病易感性的主效基因可能有較大的差異。以往在不同群體進(jìn)行易感基因的關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，同一易感基因在不同群體中作用具有差異性。所以對于在其他人群所發(fā)現(xiàn)的易感

基因，在中國北方人中重新評價就顯得非常必要，探討易感基因的分子機制在T2DM發(fā)病中的作用及其影響更有其特定的價值。研究遺傳與環(huán)境因素的交互作用，可以進(jìn)一步探討其致病的作用因素，為尋找致病線索提供依據(jù)。國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析

國內(nèi)外研究證實人們采取基因組掃描、連鎖分析和遺傳關(guān)聯(lián)的研究策略，篩查研究出的T2DM候選基因大約有500多個，其中有一些多態(tài)性可能與糖尿病的發(fā)生有關(guān)。我國對T2DM已進(jìn)行近20個候選基因研究，發(fā)現(xiàn)至少10多個基因與T2DM有關(guān)聯(lián)。從國內(nèi)外已發(fā)表的T2DM連鎖位點分布可看出：與T2DM可能連鎖的染色體位點分布非常廣泛。只找到位點，絕大多數(shù)位點尚未找到與T2DM相關(guān)的具體基因。位點不同人群、種族和國家重復(fù)性差。由此可見尋找中國人T2DM易感基因并探討其分子機制尤為重要。由于遺傳異質(zhì)性的存在，不同群體中分子遺傳學(xué)的研究結(jié)果很難得到重復(fù)。肝細(xì)胞中特異表達(dá)的過氧化物酶體增殖物的激活受體γ輔激活因子1（PPARGC1），在T2DM胰島素抵抗（IR）發(fā)生機制中起關(guān)鍵作用，作為轉(zhuǎn)錄輔激活因子，由于其參與糖代謝、脂代謝、線粒體能量代謝的調(diào)節(jié)，與T2DM的病理機制十分吻合。在T2DM患者中，其表達(dá)量的異常改變具有特征性的病理學(xué)意義，從分子生理角度上提示其是研究T2DM的機制和應(yīng)用治療的極好的切入靶點，被密切關(guān)注。為闡明PPARGC1在中國北方人群中與T2DM的風(fēng)險貢獻(xiàn)，本研究采用基因組遺傳學(xué)研究方法對PPARGC1與T2DM分子遺傳機制進(jìn)行初步探索。由于基因組DNA序列在出生后幾乎不改變，使得闡明的DNA突變可以通過人群資料的分析說明其與疾病的關(guān)系。絕大多數(shù)T2DM為散發(fā)型，對于復(fù)雜的多基因疾病，從散發(fā)群體樣本出發(fā)，通過T2DM遺傳學(xué)研究中使用最廣泛的“病例-對照”研究尋找中國北方漢族人群中T2DM的易感基因成為可行性措施。

近年來，PPARGC1中基因突變與T2DM的關(guān)系，在丹麥、日本、法國高加索人群、Pima印度安人、英國、奧地利、德國和荷蘭人群中進(jìn)行了研究。雖然由于遺傳背景的差異，不同群體中得到的結(jié)果不完全一致，但多群體中PPARGC1與T2DM的發(fā)生整體上存在關(guān)聯(lián)，丹麥人群中使用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈擴增多態(tài)性（PCR-SSCP）方法結(jié)合測序驗證，發(fā)現(xiàn)了七個突變位點：Ser74Leu，IVS2+52C>A，Asp475Asp，Gly482Ser，Thr528Thr，Thr612Met。其中Gly482Ser與T2DM有關(guān)聯(lián)。（EkJ,AndersonGetal,2001）日本人群中，通過PPARGC1基因掃描SNP后發(fā)現(xiàn)三個多態(tài)性位點：IVS4-11T>C，Thr394Thr和Gly482Ser。Gly482Ser與T2DM有關(guān)聯(lián)以及The394Thr-Gly482Ser單體型與T2DM有關(guān)聯(lián)。（HaraK,TobeK,OkadaTetal,2002）,在Pima印度安人群中也證明了Gly482Ser突變與T2DM存在關(guān)聯(lián)。繼丹麥、日本及Pima印度安人后，本研究對此基因與中國北方人群的T2DM發(fā)病關(guān)系也進(jìn)行初步探索，并發(fā)現(xiàn)PPARGC1的Gly482Ser突變能顯著增加中國北方人群的T2DM發(fā)病風(fēng)險，在男性中此趨勢更為顯著。由于此基因全面系統(tǒng)研究較少，基于前期遺傳學(xué)工作基礎(chǔ)，確證研究包括其突變基因?qū)δ艿挠绊懞瓦B接啟動子調(diào)控區(qū)序列變異對表達(dá)的影響，從兩個方面探討PPARGC1與T2DM中胰島素抵抗關(guān)系的研究仍為空白。T2DM既受遺傳因素的影響同時受環(huán)境因素的制約，傳統(tǒng)研究交互作用應(yīng)用的方法是病例對照研究，但應(yīng)用病例對照研究進(jìn)行基因—環(huán)境交合作用的研究需要很大的樣本量，同時一些潛在的因素可能會對研究結(jié)果有較大的影響。

近幾年來，研究者提出，可以用其他的研究方法進(jìn)行基因—環(huán)境交互作用的研究，例如無對照病例研究（case-only）,病例—親本研究（case-parentalstudy）等。它對于交合效應(yīng)的估計要比傳統(tǒng)病例對照研究更精確，而且將有更大的把握度檢驗交互作用的存在。同時，采用無對照病例研究探索基因與環(huán)境交互作用，可以使研究的樣本量也成本顯著降低，另外，可以避免由于采用對照可能引入的各種偏倚。無對照病例研究也存在其自身的不足，首先，無對照病例研究是基于交互作用的RR乘法模型的，它只能對交互作用是否偏離RR值乘法模型進(jìn)行檢驗。其次，無對照病例研究假設(shè)遺傳與環(huán)境之間相互獨立，研究者也常常將這種假設(shè)作為默認(rèn)前提。但在有些情況下，這個假設(shè)不能成立。另外，從其統(tǒng)計分析的過程可以看出，無對照病例研究只能檢驗基因與環(huán)境交互作用是否存在，并估計其交互效應(yīng)的大小。因為沒有對照，無法估計遺傳和環(huán)境因素的主效應(yīng)。遺傳因素在2型糖尿?。═2DM）的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。T2DM是一種多基因病，其遺傳模式有主效基因、微效基因和單基因等模式。尋找T2DM易感基因的策略主要有基因組掃描、連鎖分析和遺傳關(guān)聯(lián)研究。近年來，應(yīng)用這些遺傳學(xué)分析方法人們發(fā)現(xiàn)了一些與T2DM易感性關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域和基因，并取得了長足的進(jìn)展，但對于臨床實踐的要求仍然是杯水車薪，我們相信隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人類基因組計劃的完成，人們必將找出更多的與T2DM密切關(guān)聯(lián)的易感基因，為解釋和闡明T2DM的遺傳病理機制提供新的線索，指導(dǎo)糖尿病的預(yù)防和治療。雖然遺傳流行病學(xué)的證據(jù)提示2型糖尿病的發(fā)生具有較強的遺傳基礎(chǔ)，但因在最近10～20年內(nèi)人類的遺傳背景不會出現(xiàn)非常大的變化，糖尿病患病率的顯著增高只能用環(huán)境因素的變化來。目前，世界各國2型糖尿病患病率明顯增高的主要因素為生活方式的變化（如熱量攝入增加和體力活動減少）所導(dǎo)致的超重和肥胖；在病因?qū)W上，生活方式的改變對糖尿病患病率的影響可歸結(jié)為環(huán)境因素的影響

在T2DM實際研究中，人們采用不同的基因與環(huán)境交互作用分析方法進(jìn)行研究。例如：病例對照研究，主要采用多因素Logistic回歸的統(tǒng)計學(xué)方法、單純病例研究、不完全病例對照研究、叉生分析法等。目前在實際研究中還存在一些問題，例如：基因易感性檢測的替代方法還存在一定的局限性；還需要進(jìn)一步加大估計交互作用的樣本量。但是隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基因與環(huán)境的交互作用必將成為研究T2DM的好方法。群體遺傳學(xué)統(tǒng)計分析方法，計算相應(yīng)遺傳信息量；進(jìn)行多因素群體遺傳學(xué)研究，了解T2DM基因與傳遞模式及在家族中遺傳傳遞規(guī)律。以候選基因為標(biāo)記，與傳遞模式及在家族中遺傳傳遞規(guī)律。以候選基因為標(biāo)記，2、項目研究內(nèi)容、研究目標(biāo)以及擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題（此部分內(nèi)容為重點闡述）

項目的研究內(nèi)容：

2型糖尿?。═2DM）發(fā)病率居世界第三位，屬多基因復(fù)雜性疾病，其發(fā)病機理受環(huán)境因素與遺傳因素的綜合作用且具有高度異質(zhì)性。為開展T2DM發(fā)病的分子機制研究，分離鑒定相關(guān)致病易感基因，進(jìn)行T2DM遺傳家系現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查工作。在中國北方地區(qū)收集200個T2DM和IGT遺傳家系、散發(fā)T2DM和IGT500人和健康500人份的血樣和環(huán)境因素資料。進(jìn)行家系遺傳和表型信息收集及血生化指標(biāo)測定工作，運用擬對有關(guān)聯(lián)的編碼基因標(biāo)記按染色體分型，采用基因組改良掃描方法進(jìn)行實驗室分型。對無關(guān)聯(lián)編碼基因標(biāo)記，選用相應(yīng)數(shù)量的微衛(wèi)星進(jìn)行特定染色體掃描，尋找疾病候選位點。

同時利用PCR—RFLP分子生物學(xué)技術(shù)的實驗方法驗證已存在候選陽性基因PPARGC1的多態(tài)性。通過SAGE3.0等軟件對基因分型結(jié)果做兩點或多點的連鎖、連鎖不平衡分析及家系內(nèi)基因傳遞與分離的TDT分析，以便確定染色體不同位點與疾病的相關(guān)性。為闡明T2DM病因及發(fā)病機理，指導(dǎo)臨床預(yù)防和治療提供重要依據(jù)。1、完成T2DM家系血樣、家系遺傳和表型信息的收集以及血生化指標(biāo)測定工作。2、證實易感基因突變的臨床意義的分子研究；case-control確定易感基因與疾病相關(guān)關(guān)系和風(fēng)險數(shù)值；3、闡明2型糖尿病易感基因PPARGC1的分子機制及其對T2DM的影響；4、通過Logist回歸及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型及叉生分析進(jìn)行危險因素的遺傳與環(huán)境的交互作用分析，根據(jù)數(shù)據(jù)具體情況采用相對應(yīng)的分析方法；研究目標(biāo)：5、通過群體關(guān)聯(lián)分析和家系傳遞分析進(jìn)行人群與T2DM遺傳易感性的研究；6、同時在家系研究方面進(jìn)行有益的探索，從分子角度闡明2型糖尿病的發(fā)病機理，為2型糖尿病的基因預(yù)測提供科學(xué)依據(jù)。廣泛應(yīng)用于糖尿病的預(yù)防與治療，在條件允許的情況下應(yīng)用于臨床診斷。

擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題：1.進(jìn)行本課題工作所面臨的最主要的問題，就是采用什么樣的策略進(jìn)行易感基因篩查工作，國內(nèi)外此領(lǐng)域的研究者經(jīng)過多年經(jīng)驗，目前認(rèn)為，對于多基因復(fù)雜性疾病，其最主要的易感基因研究策略不能單純效仿單基因疾病或單表型形狀決定基因的尋找模式。2.T2DM發(fā)病過程中，每個基因參與發(fā)病程度不等，大多數(shù)基因以微效基因模式參與其中，每個基因只是賦予個體某種程度的易感性，就每個易感基因而言均非發(fā)病所必須；而且，個基因可能通過各自不同的途徑或發(fā)揮不同作用參與發(fā)病過程；最后，各基因致病效應(yīng)之累積結(jié)合環(huán)境因子的作用構(gòu)成個體的T2DM的易感性。3.由于其主要以散發(fā)的形式在群體中流行，并且本質(zhì)的病因?qū)W起源各異，因此，基于經(jīng)典家系資料樣本利用分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析定位克隆的策略是不夠妥當(dāng)?shù)?。另外，由于大多?shù)T2DM的發(fā)病年齡集中在中青年以后，并且有增齡性的發(fā)生趨勢，由于人類的整體壽命的上限限制，多代患者間同時存在T2DM發(fā)生的幾率很低。因此，從風(fēng)險等位基因在多代間的傳遞規(guī)律上分析基因的T2DM易感性，也是受到限制的，一般情況不只能進(jìn)行到2代間分子標(biāo)記的傳遞研究。4.“病例—對照”研究是預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中流行病學(xué)的經(jīng)典研究策略，不同于經(jīng)典遺傳學(xué)的理論，它研究的是在現(xiàn)實群體中，某種疾病相關(guān)的環(huán)境因素或遺傳性內(nèi)因的暴露和該疾病的人群分布狀態(tài)，通過該策略，最終擬解決的問題，是該人群不同程度下暴露的環(huán)境因素或遺傳性內(nèi)因與疾病的關(guān)系，并且希望得到的是適合于指導(dǎo)本人群中絕大多數(shù)人進(jìn)行疾病預(yù)防和早期干預(yù)的信息。5.對于人群中現(xiàn)實存在的復(fù)雜多基因疾病的易感基因篩查，由于該疾病的特點，決定了預(yù)防醫(yī)學(xué)學(xué)科和生物學(xué)學(xué)科的相互滲透和結(jié)合。應(yīng)運而生地，基于隨機群體中收集的T2DM患者和正常NGT對照人群資料進(jìn)行“病例—對照”研究，是現(xiàn)代國際上尋找人群中的T2DM分子病因?qū)W因素的主流策略。同時考慮遺傳與環(huán)境交互作用的影響。6.目前研究認(rèn)為，除了T2DM中的主效基因模式類型外，研究其易感基因時采用相關(guān)分析比連鎖分析更有效，但由于連鎖不平衡僅存在于染色體上極窄的區(qū)域內(nèi)（在混合人群中，連鎖不平衡的范圍僅為2.5-10kb），因此要想通過基于連鎖不平衡的相關(guān)分析進(jìn)行基因組掃描，遺傳標(biāo)志的密度需要在5-20kb才能保證所有的易感基因均被檢測到，這要求分布于整個基因組的極高密度的遺傳標(biāo)志，目前所認(rèn)識的遺傳標(biāo)志中，只有單核苷酸多態(tài)性（SNP）符合這一要求。7.由于相關(guān)分析所需的樣本量較大，因而整個掃描工作的工作量將會非常巨大，這就要求遺傳標(biāo)志的檢測功能自動化進(jìn)行，SNP的檢測手段正是朝著這一方向發(fā)展，因而極有可能成為未來研究糖尿病等多基因疾病相關(guān)基因的重要工具。8.SNP作為有效的研究工具，是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性。在人群中的發(fā)生頻率大于1%。SNPs包含了基因組已知多態(tài)性的80%-90%是最常見的遺傳變異類型。遺傳的選擇壓力導(dǎo)致SNP在單個基因及整個基因組中的分布是不均勻的，在基因編碼區(qū)大約有200,000個SNPs，稱cSNPs，與蛋白質(zhì)功能有關(guān)，在非編碼區(qū)的SNPs稱ucSNPs。非編碼區(qū)的SNP比編碼區(qū)的SNP多。擬采取的研究方案：

1、本研究考慮到T2DM屬于多基因復(fù)雜性疾病，并且以散發(fā)為主的特征，以散發(fā)群體篩查為主導(dǎo)，小家系進(jìn)行垂直驗證為輔助參考，進(jìn)行T2DM易感基因的關(guān)聯(lián)篩查和驗證工作。T2DM以候選基因為標(biāo)記，采用基因組改良掃描方法進(jìn)行實驗室分型。2、擬對有關(guān)聯(lián)編碼基因標(biāo)記按染色體分型，可通過PCR-RFLP方法電泳定型在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳定型、銀染、酶切，確定基因型。對無關(guān)聯(lián)編碼基因標(biāo)記，選用相應(yīng)數(shù)量的微衛(wèi)星進(jìn)行特定染色體的掃描，來尋找疾病候選位點?；蚍中徒Y(jié)果通過遺傳學(xué)統(tǒng)計軟件SAGE3.0、Genehunter2.0、Allegro等軟件作兩點或多點的連鎖和連鎖不平衡分析和家系內(nèi)基因傳遞和分離的TDT分析，以便確定染色體不同位點與疾病的相關(guān)性，并通過LOD分?jǐn)?shù)高低定位某些排序有高概率的位點基因3、按DM的病因?qū)W，除需要精細(xì)定位，還需要有可靠的群體case-control驗證。所有擬定的候選易感基因，需要進(jìn)行良好匹配，有足夠數(shù)量的case-control驗證和比較，進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測檢查有否人群代表性。有良好的實驗室質(zhì)控，以保證實驗穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠。采用傳統(tǒng)的連鎖和連鎖不平衡分析方法進(jìn)行遺傳學(xué)統(tǒng)計分析。有完整父母信息的可用TDT方法進(jìn)行分離分析傳遞不平衡檢測。4、采用Logist回歸及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型及叉生分析進(jìn)行危險因素的遺傳與環(huán)境的交互作用分析。根據(jù)數(shù)據(jù)具體情況采用相對應(yīng)的分析方法。研究方法1、本研究中涉及的尋找疾病易感基因的策略人類基因組計劃完成后，基因組DNA序列明確將簡化識別疾病易感基因的步驟。候選克隆技術(shù)正成為復(fù)雜形狀基因克隆的一種快捷高效的策略。目前研究糖尿病相關(guān)基因常用的技術(shù)是基因組掃描和連鎖分析，連鎖分析適用于分析基因型與表型有較密切關(guān)系，且疾病表型較單一的致病基因，而對于以多個微效基因為特征的T2DM易感基因的定位克隆不太適用。一般認(rèn)為：研究T2DM等多遺傳因素及環(huán)境因素參與的復(fù)雜性疾病時，采用基因群體的基因組SNP“case-control”關(guān)聯(lián)分析，特別是基于連鎖不平衡（linkagedisequilibrium,LD）的關(guān)聯(lián)分析比連鎖分析更有效。關(guān)聯(lián)分析是基于群體中無親緣關(guān)系的病例組和表現(xiàn)型正常的對照組在某個遺傳標(biāo)記位點上會出現(xiàn)不同的頻率而設(shè)計的。通過兩者頻率的不同，就能推測所研究的

遺傳標(biāo)記和某個遺傳病易感位點之間是否存在因果關(guān)系或連鎖不平衡。

此領(lǐng)域內(nèi)目前被更多數(shù)人接受的理論基礎(chǔ)為“常見疾病—-常見變異”假說（commondisease,commonvariant,CDCV），該假說認(rèn)為，T2DM等常見疾病的患病風(fēng)險，主要由基因組常見變異積累造成，而非依賴于罕見的稀有基因組變異，后者在單基因疾病多多基因疾病中的主效基因模式中占主要地位。

常見疾病多由一種以上基因異常及致病環(huán)境因子呈正性或負(fù)性相互作用而引起。每個微效基因只賦予個體某種程度的易感性，就每個易感基因而言均非發(fā)病所必需。因此，單純依靠連鎖分析的方法進(jìn)行復(fù)雜性疾病易感基因的尋找和定位時，基于CDCV的理論假設(shè)其檢驗的效能相對偏低，其最終很難在群體中得到相對一致的結(jié)果。

1）連鎖不平衡和單體型分析

連鎖不平衡是指相鄰基因座位上等位基因的非隨機相關(guān)，也就是指：當(dāng)不同位點的等位基因以單體型組合形式出現(xiàn)的幾率高于隨機分布而同時出現(xiàn)的幾率時，那么稱這兩個位點處于連鎖不平衡狀態(tài)。用公式描述和衡量LD如下：假設(shè)相鄰基因座位1和2，座位1的等位基因為M，m，其頻率分別為PM，Pm；座位2的等位基因為N，n，其頻率分別為PN，Pn；等位基因M和N在同一染色體上同時出現(xiàn)的理論頻率為PM×PN，而實際出現(xiàn)的頻率為PMN，那么，連鎖不平衡的D值為PMN-PM×PN。LD的存在，可以歸因為兩種因素：一是由突變產(chǎn)生的多態(tài)性而形成，之后由于重組的發(fā)生，兩位點間的LD程度逐漸減低；另一種是由于分子標(biāo)記物理距離的靠近，由于發(fā)生重組的概率降低，而呈現(xiàn)出高LD的

表現(xiàn)。但值得注意的是，靠得很近的分子標(biāo)記間并非總呈現(xiàn)出強的LD，相反，也有數(shù)據(jù)顯示，對于距離較遠(yuǎn)的分子標(biāo)記間也存在LD的狀態(tài)。此外，一部分LD也可能由于遺傳漂變和群體混雜而產(chǎn)生。LD的度量有多種不同的方法，大多數(shù)都應(yīng)用于雙等位基因的配對檢驗。目前常用的兩種配對檢驗方法為連鎖不平衡系數(shù)（coefficientoflinkagediseruiligrium，D′）和r2。它們的取值范圍都是從0（連鎖平衡）到1（完全連鎖不平衡）。

分子標(biāo)記間LD存在，是繼續(xù)進(jìn)行標(biāo)記間單體型塊（haplotypeblock）構(gòu)建的前提條件。同一條染色體上的單體型結(jié)構(gòu)，可被劃分為一系列彼此分離的單體型塊，其大小為3-92kb左右。這些單體型塊被重組熱點所分割，其內(nèi)部重組率很低，處于高LD的狀態(tài)。

基于此理論基礎(chǔ)，如果單體型塊的結(jié)構(gòu)在基因組中普遍存在，那么基于群體的“病例-對照”關(guān)聯(lián)研究所

需要的SNP數(shù)量將大為縮小，并且還能在后續(xù)的分析中，體現(xiàn)功能性等位基因效應(yīng)的相互疊加，無論是作為非功能的分子標(biāo)志，還是作為有功能的等位基因的組合，其都具有更可持續(xù)推廣的應(yīng)用效力而被作為目前最常見的工具而得到廣泛應(yīng)用。

定義單體型塊的方法很多，目前大多數(shù)學(xué)者更傾向于利用配對的連鎖不平衡系數(shù)D′以確定重組熱點，因為測量重組似乎更符合單體型塊的本質(zhì)，并且，利用配對連鎖不平衡系數(shù)D′更合適于雙等位基因。2）連鎖不平衡、傳遞不平衡（transmissiondisequilibriumtest，TDT）和關(guān)聯(lián)研究

將連鎖不平衡應(yīng)用于大規(guī)模的關(guān)聯(lián)研究或針對特定染色體區(qū)段，甚至針對單基因的進(jìn)行系統(tǒng)性SNP掃描分析，可用尋找和定位復(fù)雜性疾病的致病基因。連鎖不平衡狀態(tài)的存在，既可能提示繼續(xù)進(jìn)行單倍體塊分析的可能性，本身也預(yù)示可能起基因組區(qū)域附近存在功能性的突變位點。連鎖不平衡分析和關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果是互通的。

傳遞不平衡檢驗是基于家系樣本的另一種形式的關(guān)聯(lián)研究。由于在群體關(guān)聯(lián)研究的實驗設(shè)計中，各環(huán)節(jié)都有可能影響數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性，特別是研究群體的選擇最為重要?；谏l(fā)群體的關(guān)聯(lián)研究雖然有上述提到的策略優(yōu)勢，但是先證者效應(yīng)、種族差異以及群體性別、年齡結(jié)構(gòu)的差異，都可能出現(xiàn)所謂的“群體分層”，從而導(dǎo)致某基因位點與疾病存在相關(guān)的假陽性結(jié)果。傳遞不平衡不依賴于有群體分層可能的散發(fā)人群，而在相對背景一致的家系中進(jìn)行研究。選擇一個受累家庭內(nèi)對照組。發(fā)現(xiàn)可以關(guān)聯(lián)時，運用TDT需要測定患者及其父母標(biāo)記物基因型。它是基于尋找假定的致疾病等位基因由雜合子父母傳遞給患病子女的不平衡傳遞性，而推測致病基因是否存在的方法?？梢越Y(jié)合散發(fā)群體的研究結(jié)果進(jìn)行回顧性傳遞規(guī)律驗證研究。

在關(guān)聯(lián)研究中，如果某一因素可增加某疾病的發(fā)生風(fēng)險，而該因素在疾病人群中的頻率高于正常人群，可認(rèn)為該因素與疾病相關(guān)聯(lián)。關(guān)聯(lián)研究中，主要關(guān)注基于LD的間接關(guān)聯(lián)分析，其基本原理為：如果某致病基因座與遺傳標(biāo)記（多態(tài)性的等位基因）存在強的LD關(guān)系，那么可以通過比較遺傳標(biāo)記在患者于正常個體間差異，最終得到該致病基因座在疾病發(fā)生中相對危險度。3)2型糖尿病的多為點單倍體遺傳分析

單倍體型是傾向于共同遺傳的一組緊密連鎖的等位基因，可用于精細(xì)定位人類疾病基因。我們所有的染色體

均成對出現(xiàn)，一對染色體中每條分別來自父母一方，上面的基因及其排列順序雖一致，但其序列并不相同。例如，每1000個核苷酸就存在一個單核苷酸多態(tài)性，因而區(qū)分來源于父母親的變異體是可能的，稱為父源或母源的等位基因。對父源或母源等位基因的區(qū)分使人類的疾病基因得以通過連鎖分析定位到染色體某一位置上。在產(chǎn)生精子和卵子的生殖細(xì)胞中，父母源染色體配對并交換部分DNA片段，發(fā)生重組過程。重組之后，染色體稱為福怒雙親等位基因的混合體。重組更多的發(fā)生在距離較遠(yuǎn)的DNA序列之間，因此，通過衡量疾病基因與已知位置序列之間的重組頻率可以定位疾病基因。重組的另一結(jié)果是同一染色體上某些區(qū)段的序列傾向于共同遺傳，稱為連鎖不平衡的現(xiàn)象。這樣一組極少被重組打破的等位基因，構(gòu)成單倍體型，在人類基因組中，單倍體型大小約為60000bp左右，可能包含的SNP位點約60個。單倍體型可被用于精細(xì)定位疾病等位基因，一個導(dǎo)致遺傳疾病的新突破總是發(fā)生在一個群體已有的單倍體型之內(nèi)，經(jīng)過幾代傳遞，重組事件可能發(fā)生在此單倍體型之內(nèi)，但疾病等位基因仍然與最近的SNP組合在一起遺傳，如果此單倍體型可以在一組病人中鑒定，在單倍體型內(nèi)分型等位基因便可以使一個保守區(qū)域得以鑒定，此保守區(qū)域與致病基因指向同一染色體區(qū)段。由于SNP標(biāo)記具有非常準(zhǔn)確的定位致病基因的潛力，因而科學(xué)家有興趣構(gòu)建整個人類基因組單倍體圖譜。

單倍體型分析對復(fù)雜遺傳病的易感基因連鎖分析具有重要作用，已成為不可缺少的通過連鎖分析精確定位致病基因的方法，在2型糖尿病等復(fù)雜遺傳疾病的易感基因精細(xì)定位方面得到廣發(fā)應(yīng)用。

2研究候選突變位點在家系中的垂直傳遞規(guī)律方法：使用的樣本為采集T2DM病例對照樣本的同時，同時收集的部分T2DM先證者的家系資料。家系入選的標(biāo)準(zhǔn)如下：1）入選的家系每個家系成員3人以上，包含1名T2DM的先證者在內(nèi)至少有2個以上診斷明確的T2DM患者，如先證者與其一個同胞為T2DM患者，即為符合入選標(biāo)準(zhǔn)的家系。2）入選家系收集的信息和標(biāo)本包含兩代人以上，如先證者及其配偶與子女或先證者及其父母。家系結(jié)構(gòu)類型如圖1-1所示。電話約請先證者及其父、母、患者和未患者的同胞等其它家系成員，所有受試者均簽署知情同意書。于空腹12小時后，次日早晨進(jìn)行口服75克葡萄糖耐量試驗（OGTT）分別測定0、30、60、120及180分鐘血糖、胰島素、空腹血糖。T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)WHO1999年標(biāo)準(zhǔn)。3）共采集120個家系，先證者為候選突變Gly482Ser的突變雜合子的家系被二篩挑選出來，進(jìn)行后續(xù)的家系傳遞研究，確定最終納入的核心小家系。臨床信息和血生化指標(biāo)測定

依據(jù)1999年WHO糖尿病專家委員會制訂的糖尿病診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)：1）有糖尿病癥狀，并且任意血糖≧11.1mmol/l。2）空腹血糖≧7.0mmol/l。3）糖耐量試驗餐后2小時血糖≧11.1mmol/l。OGTT按世界衛(wèi)生組織要求進(jìn)行。符合上述標(biāo)準(zhǔn)之一的患者，在另一天重復(fù)上述檢查，若仍符合三條標(biāo)準(zhǔn)之一，即診斷為糖尿病。糖耐量試驗服糖后2小時血糖≧7.8mmol/l，但又低于11.1mmol/l診斷為糖耐量減低?？崭寡歉哂诨虻扔?.1mmol/l，但又低于7.0mmol/l診斷為空腹葡萄糖受損。技術(shù)路線

考慮到T2DM屬于多基因復(fù)雜性疾病，并且以散發(fā)為主，所以，T2DM的易感基因的尋找不適合使用家系資料的連鎖分析。此外，T2DM的發(fā)病有增齡性變化的特征，所以從家系入手進(jìn)行傳遞不平衡檢驗也不能作為首選研究策略。本研究采用四步法進(jìn)行T2DM易感基因的關(guān)聯(lián)篩查和驗證工作，以散發(fā)群體篩查為主導(dǎo)，小家系進(jìn)行垂直驗證為輔助參考，主要技術(shù)路線設(shè)計如下圖：T2DM診斷，樣本采集，流行病學(xué)調(diào)查基因組DNA提取、生化指標(biāo)測定小樣本直接掃描PPARGC1編碼區(qū)和啟動子區(qū)SNP，進(jìn)行預(yù)篩查，根據(jù)MAF、雜合度等信息，選擇進(jìn)入后續(xù)研究。小群體等位基因分型，進(jìn)行單基因遺傳學(xué)分析，根據(jù)HWE、分布顯著性、OnewayANOVA、LD及Logistic去除混雜后，選擇SNP進(jìn)入后續(xù)研究第一步第二步陽性SNP利用核心小家系驗證，通過傳導(dǎo)不平衡檢驗和同胞對檢驗分析去除人群分層后陽性突變位點在家系中的傳遞規(guī)律傳遞與環(huán)境因素的交互作用分析，尋找發(fā)病原因的證據(jù)：探索PPARGC1的分子機制T2DM大群體中等位基因分型，進(jìn)行多因素分析，根據(jù)HWE檢驗、分布顯著性、LD及單體型構(gòu)建，分析基因互作效應(yīng)，比較基因型間臨床指標(biāo)差異第三步第四步可行性分析：

目前已完成北方125個家系及散發(fā)病例320名和正常對照320名的調(diào)查工作，獲取到血樣、提取出DNA，完成了生化指標(biāo)的檢測工作同時，進(jìn)行了環(huán)境、遺傳因素的調(diào)查也數(shù)據(jù)初步分析。驗證了2個PPARGC1易感基因與T2DM關(guān)聯(lián)的多態(tài)性位點，同時做了家系傳遞分析及基因間交互作用的分析。正在補充完善家系資料及資料搜集工作。方法成熟、技術(shù)路線可行。前期的國家自然科學(xué)基金項目的進(jìn)行為本研究積累一定的工作基礎(chǔ)。采樣過程中我們注意了醫(yī)學(xué)倫理問題：在目前的醫(yī)學(xué)工作中面臨諸多嚴(yán)峻的倫理問題，如遺傳信息的隱私權(quán)問題、基因組圖譜的信息使用與人的社會權(quán)利、基因組研究成果應(yīng)用的不可預(yù)測性等。我們已經(jīng)注意到這一問題，并提請哈爾濱科大學(xué)醫(yī)學(xué)理論委員會論證，最終獲得批準(zhǔn)通過。因此我們在項目申請的過程中，已經(jīng)著手準(zhǔn)備妥善解決此問題，如果基金申請順利通過，我們有能力解決好次問題。并將嚴(yán)格實行知情同意制度，每位患者均簽署知情同意書，并與患者保持密切聯(lián)系，及時將研究成果向患者反饋，維護患者的權(quán)益。

本項目的特色與創(chuàng)新之處：

分子生物學(xué)與社會醫(yī)學(xué)研究方法相結(jié)合，遵循現(xiàn)代社會醫(yī)學(xué)研究模式為本項目特色

近年，隨著分子生物學(xué)理論及技術(shù)的發(fā)展，尤其是人類基因組計劃研究迅速進(jìn)展和突破、基因定位技術(shù)經(jīng)驗的積累及統(tǒng)計分析方法的進(jìn)步，使得2型糖尿病的分子遺傳學(xué)研究有了長足進(jìn)展。闡明參與2型糖尿病的易感基因種類、特性及機制是2型糖尿病分子遺傳學(xué)研究的目標(biāo)之一。目前比較常用的是采用候選基因的功能區(qū)或非功能區(qū)多態(tài)標(biāo)記進(jìn)行。本項目將從預(yù)防醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、社會醫(yī)學(xué)研究三個層次對北方地區(qū)T2DM的流行現(xiàn)狀、致病的遺傳、環(huán)境、社會因素的交互作用研究。進(jìn)而為使得T2DM的預(yù)防治療遵循現(xiàn)代社會醫(yī)學(xué)模式奠定基礎(chǔ)。

群體關(guān)聯(lián)分析，或是采用隨機DNA位點或候選基因的高雜合度非功能區(qū)多態(tài)標(biāo)記進(jìn)行家系分析。2型糖尿病受到遺傳基因與環(huán)境條件的雙重調(diào)控。不同遺傳背景的人群糖尿病易感性的主效基因可能有較大的差異。以往在不同群體進(jìn)行易感基因的關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，同以易感基因在不同群體中作用具有差異性。所以對于在其他人群所發(fā)現(xiàn)的易感基因，在中國北方人中重新評價其遺傳與環(huán)境的交互作用就顯得非常必要，探討易感基因的分子機制在T2DM發(fā)病中的作用及其影響更有特定的價值。年度研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果。（包括擬組織的重要學(xué)術(shù)交流活動、國際合作與交流計劃等）年度研究計劃：本研究預(yù)計執(zhí)行期為3年，具體階段計劃于目標(biāo)為：2011年1月-2011年4月查閱文獻(xiàn)，撰寫開題報告；設(shè)計調(diào)查表、確定遺傳因素和環(huán)境因素的變量。2011年5月-2011年12月開展流行病學(xué)調(diào)查和體驗工作進(jìn)行家系和散發(fā)病例收集及血樣采集、進(jìn)行預(yù)實驗2012年1月-2012年4月完成DM和IGT家系血樣、家系遺傳和表型信息的收集以及血生化指標(biāo)測定工作2012年5月-2012年12月開展DM候選基因生物信息學(xué)研究、完善數(shù)據(jù)庫、撰寫綜述發(fā)表文章2013年1月-2013年7月對一系列候選基因位點進(jìn)行實驗室PPARC1基因分型，獲得基線數(shù)據(jù)2013年8月-2013年10月開始數(shù)據(jù)匯總，進(jìn)行基因信息和家系信息的分析和T2DM危險因素交互作用處理分析2013年11月-2013年12月結(jié)題撰寫科研工作總結(jié)報告、申請成果、發(fā)表文章

預(yù)期研究結(jié)果：

確定經(jīng)實驗驗證2個以上與T2DM易感基因PPARGC1的位點，力爭發(fā)表1篇SCI文章。提交一份工作總結(jié)報告，發(fā)表國家核心期刊文章1-2篇以上；可能情況下，申請國家或省級科研成果1-2項；同時參加國際、國內(nèi)學(xué)術(shù)交流會議各一次；培養(yǎng)2名碩士。（二）、研究基礎(chǔ)與工作條件1、工作基礎(chǔ)（與本項目相關(guān)的研究工作積累和已取得的工作成績）2、工作條件（包括已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑，包括利用國家實驗室、國家重點實驗室和部門重點實驗室等研究基地的計劃與落實情況）

申請者所在單位有國家重點實驗室及省重點實驗室，實驗設(shè)備齊全，儀器先進(jìn)，能保證課題順利進(jìn)行。該單位實驗室具有現(xiàn)代分子生物學(xué)的儀器設(shè)備如高速離心機，酶標(biāo)儀，超純水器和電泳儀，PCR儀，DNA測序儀，高速冷凍離心機，數(shù)據(jù)成像系統(tǒng)，生化檢測儀，核酸/蛋白分析儀，高壓液相色譜和17A氣象色譜等。本實驗室利用這些儀器先后承擔(dān)了多項國家自然科學(xué)基金資助的研究工作，并取得了較為滿意的實驗結(jié)果。因此，已經(jīng)具備完成該課題的能力和條件。由于本課題系前一自然科學(xué)基金項目的后續(xù)研究內(nèi)容，采用的實驗方法需要購買一定量分子生物學(xué)實驗樣品及生物試劑，尚缺少一部分圖書資料及相應(yīng)的遺傳統(tǒng)計分析軟件。如能得到國家自然科學(xué)基金的資助，本課題在我單位領(lǐng)導(dǎo)鼓勵支持及其他單位的合作下可以順利完成。

3.申請人簡介：（包括申請人和項目組主要參與者的學(xué)歷和研究工作簡歷，近期已發(fā)表與本項目有關(guān)的主要論著目錄和獲得學(xué)術(shù)獎勵情況及在本項目中承擔(dān)的任務(wù)。論著目錄要求詳細(xì)列出所有作者、論著題目、期刊名或出版社名、年、卷（期）、起止頁碼等；獎勵情況也須詳細(xì)列出全部受獎人員、獎勵名稱、授獎年限等）

4.承擔(dān)科研項目情況（申請人和項目組主要參與者正在承擔(dān)的科研項目情況，包括自然科學(xué)基金的項目，要注明項目的名稱和編號、經(jīng)費來源、起止年月、與本項目的關(guān)系及負(fù)責(zé)的內(nèi)容等）

5.完成自然科學(xué)基金項目情況（對申請人負(fù)責(zé)的前一個已結(jié)題科學(xué)基金項目（項目名稱及批準(zhǔn)號）完成情況、后續(xù)研究進(jìn)展及與本申請項目的關(guān)系加以詳細(xì)說明。另附該已結(jié)題項目研究工作總結(jié)摘要（限500字）和相關(guān)成果的詳細(xì)目錄）研究生開題論證報告例1:

一、題目名稱：牛奶對幼兒生長發(fā)育

的影響二、選題依據(jù)：（1）國外情況1、牛奶的營養(yǎng)成份與母乳很相似。2、國外不同國家都有過類似研究，但結(jié)果不一致。3、牛奶來源方便、價格便宜、無異味、口感好。4、人工合成乳制品種類繁多。（2）國內(nèi)研究情況

1、國內(nèi)尚未開展嚴(yán)格的實驗研究，只憑經(jīng)驗的感性認(rèn)識。2、用其它小型哺乳動物被喂養(yǎng)獲得成功。（3）當(dāng)前存在的主要問題

1、缺乏一種統(tǒng)一的、規(guī)范的、標(biāo)準(zhǔn)的、科學(xué)性強的研究設(shè)計方法對牛奶喂養(yǎng)效果評價。

2、缺乏統(tǒng)一的科學(xué)評價指標(biāo)體系。3、缺乏對不同乳制品喂養(yǎng)效果的比較研究。三、參考文獻(xiàn)（略）

四、目的意義

目的：正確評價牛奶對幼兒生長發(fā)育的影響。意義：1、有利于替代母乳喂養(yǎng)的奶類制品的合理應(yīng)用。2、有利于幼兒用科學(xué)加工、合理配料的牛奶。3、有利于奶制品行業(yè)的科學(xué)健康發(fā)展。五、研究內(nèi)容、研究方法和技術(shù)路線（一）研究內(nèi)容

1、牛奶主要營養(yǎng)素定量檢測方法研究。2、幼兒生長指標(biāo)、發(fā)育指標(biāo)的定量評價體系的研究。3、適合中國幼兒生長、發(fā)育質(zhì)量的評價量表的構(gòu)建。（二）研究方法1、研究對象①在廣州市隨機整群抽取10個托兒所（每個所入托幼兒≥200人），1歲≤年齡≤2歲；近三月內(nèi)無腹瀉、肝功能異常、不明原因發(fā)熱，易感冒等疾病。②每個托兒所中符合上述條件的幼兒隨機分為A、B、C三組，每組50人，加10％的失訪率，故每組實際人數(shù)為60人。三組的組間特征具有可比性（即無統(tǒng)計學(xué)差異）。

2、研究因素①牛奶來自同一品牌、批號、規(guī)格、日期、密封運輸、專人專車發(fā)送。②每批牛奶開啟后要留樣做常規(guī)質(zhì)量檢測。③豆?jié){也是同一廠家、同一日期、批號、規(guī)格。每批使用前要留樣做常規(guī)質(zhì)量檢測。④實施方案：A組牛奶、B組為豆?jié){、C組淀粉，用正常奶瓶裝、外觀無差別，但編組瓶底作暗號，依次分別為（

，

，

），每瓶200ml。用法：每天空腹一瓶。采樣：每月抽血一次，檢測各項效應(yīng)指標(biāo)，試驗開始當(dāng)時為第一輪本底樣品，到第三個月時采第三次，然后再過7天采最后一次為終末樣品，前后共采四次。3、研究效應(yīng)指標(biāo)..

①

體液免疫指標(biāo)②

細(xì)胞免疫指標(biāo)

③

生長指標(biāo)④

發(fā)育指標(biāo)

⑤

疾病情況

隨時登記}每月一次，最后一次后7天再檢一次。}每10天測一次，其余同上。六、技術(shù)路線項目啟動樣本確定整群隨機抽樣選定十個情況相似的幼兒園每個幼兒園都按照以下處理A組C組B組①②③①②③①②③制定幼兒健康調(diào)查量表第一次體檢和血樣采集①