微生物脂肪酶的研究與應(yīng)用

微生物脂肪酶的研究與應(yīng)用

微生物脂肪酶（lee3.1.3，甘油三酰酯水解酶）是一種能夠誘導(dǎo)長(zhǎng)鏈脂肪酸甘油酯水解到甘油和長(zhǎng)鏈脂肪酸的酶類（或反應(yīng)的逆反應(yīng)）。除了能催化水解反應(yīng)和酯化反應(yīng)外,脂肪酶還能催化酯交換反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯反應(yīng)、醇解反應(yīng)、酸解反應(yīng)以及氨解反應(yīng)等多種化學(xué)反應(yīng)。脂肪酶催化的化學(xué)反應(yīng)具有嚴(yán)格的底物專一性,如化學(xué)選擇性、立體選擇性、位點(diǎn)選擇性等,催化活性高而副反應(yīng)少,催化反應(yīng)過(guò)程不需要輔助因子等特點(diǎn),因此被廣泛應(yīng)用于食品加工、油脂加工、新型生物材料、生物傳感器、生物醫(yī)學(xué)、化妝品、殺蟲(chóng)劑、生物柴油、去污劑、皮革加工、造紙、生物修復(fù)、醫(yī)藥、精細(xì)化工、去污劑的添加劑、造紙、皮革等多種工業(yè)領(lǐng)域。通過(guò)各種技術(shù)手段,篩選、挖掘并開(kāi)發(fā)出具有新型催化活性或高度穩(wěn)定性的微生物脂肪酶,滿足各種酶促反應(yīng)體系(尤其是各種極端酶促反應(yīng)體系,如造紙行業(yè)的強(qiáng)堿性和高溫、生物柴油生產(chǎn)工藝中的高濃度短鏈醇等)的工藝要求,以期進(jìn)一步擴(kuò)大脂肪酶的應(yīng)用領(lǐng)域,提高脂肪酶的催化效率和重復(fù)利用率,降低生產(chǎn)成本,具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。1極端微生物及古細(xì)菌的脂肪酶檢測(cè)各種極端微生物(包括古細(xì)菌)為了適用其所處的惡劣生境,常常分泌一些在該惡劣生境下仍具有高度穩(wěn)定性和催化活性的胞外酶或胞內(nèi)酶。從嗜熱(Thermophile)、嗜冷(Psychrophile)、嗜酸(Acidophile)、嗜堿(Alkalophile)、嗜鹽(Halophile)、嗜壓(Piezophile)、嗜金屬(Metalophile)、嗜輻射(Radiophile)、嗜微氣性(Microaerophile)、高有機(jī)溶劑耐受性(Organicsolventtolerant)等各種嗜極性微生物及古細(xì)菌中,篩選出具有新型催化性質(zhì)的酶,已成為尋找新型工業(yè)酶制劑的常規(guī)方法。利用這種方法,已從各種極端微生物及古細(xì)菌中成功篩選到一批性能優(yōu)良、具有開(kāi)發(fā)潛力的新型微生物脂肪酶,部分脂肪酶基因被克隆并在異源宿主中實(shí)現(xiàn)了大量表達(dá)。表1列舉了幾種極端微生物(古細(xì)菌)分泌的脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)。國(guó)內(nèi)對(duì)低溫脂肪酶和高溫脂肪酶的研究比較活躍,但對(duì)其他極端脂肪酶的研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)已建立起多種極端環(huán)境條件下的產(chǎn)脂肪酶菌種庫(kù),并對(duì)低溫羅倫隱球酵母脂肪酶(最適作用溫度為25°C～30°C)的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。在耐受性(或適應(yīng)性)機(jī)制研究方面,低溫脂肪酶適應(yīng)性機(jī)制和高溫脂肪酶耐受性機(jī)制研究得比較透徹,而對(duì)其他各種極端微生物脂肪酶的耐受性(或適應(yīng)性)機(jī)制鮮有研究。解析各種極端微生物脂肪酶的結(jié)構(gòu),澄清其耐受性(或適應(yīng)性)機(jī)制,借助現(xiàn)代蛋白質(zhì)工程技術(shù),對(duì)其它脂肪酶分子進(jìn)行理性設(shè)計(jì),有望獲得預(yù)期的新型脂肪酶分子。值得注意的是,微生物對(duì)某種極端環(huán)境的耐受能力與其是否處于某種極端環(huán)境并無(wú)必然的聯(lián)系。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道,從各種非極端環(huán)境中分離篩選到對(duì)某種極端環(huán)境具有高度耐受性的微生物菌株或新型極端耐受性(適應(yīng)性)的酶。因此,利用現(xiàn)代分析技術(shù),對(duì)現(xiàn)有的各種產(chǎn)脂肪酶微生物及其分泌的脂肪酶進(jìn)行更深入的研究,有可能發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有脂肪酶具有的某些新性質(zhì)。2高通量篩選技術(shù)自然環(huán)境中99%的微生物利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)基未能實(shí)現(xiàn)純培養(yǎng),挖掘并開(kāi)發(fā)未可培養(yǎng)微生物(Unculturedmicrobes)的基因資源,是當(dāng)前微生物學(xué)和酶學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。篩選未培養(yǎng)微生物基因資源技術(shù)主要涉及兩個(gè)方面：利用Cosmid、Fosmid和Bacterialartificialchromosome等載體構(gòu)建宏基因組文庫(kù)和基于功能篩選(Function-basedscreening)、序列篩選(Sequence-basedscreening)、底物誘導(dǎo)基因表達(dá)篩選(Substrate-inducedgeneexpressionscreening)等高通量篩選技術(shù)對(duì)宏基因組文庫(kù)進(jìn)行篩選等。利用宏基因組技術(shù)已成功地從環(huán)境樣品中克隆到脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、加氧酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、乙醇氧化還原酶、β-內(nèi)酰胺酶等多種新型酶基因序列。利用宏基因組技術(shù),Ranjan從池水樣品中一次性克隆到12個(gè)脂解酶基因,其中一個(gè)基因編碼的氨基酸序列與已知蛋白的同源性僅為25%;H?rdeman和張金偉利用宏基因組技術(shù)分別從海洋沉積物中克隆到新型低溫脂肪酶的編碼基因;Tirawongsaroj利用宏基因組技術(shù)從溫泉的泥樣中直接克隆到耐高溫的脂解酶編碼基因。目前,制約宏基因組技術(shù)發(fā)展的主要因素是高通量篩選技術(shù)。基于序列篩選的篩選技術(shù)花費(fèi)昂貴,而功能篩選的篩選技術(shù)必須以成熟的表達(dá)系統(tǒng)作為基礎(chǔ)。由于宏基因組中的基因序列具有高度的多樣性和個(gè)體的復(fù)雜性,沒(méi)有任何一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)能滿足宏基因組中所有基因的功能性表達(dá)。為了克服上述篩選技術(shù)方面的局限性,Bell根據(jù)脂肪酶分子的保守性氨基酸設(shè)計(jì)特異性的引物,成功地以宏基因組DNA為模板,直接PCR擴(kuò)增獲得新型的脂肪酶基因資源。3高通量定向篩選技術(shù)隨著越來(lái)越多微生物全基因組測(cè)序工作的完成,分析、注釋和挖掘出這些基因組序列中蘊(yùn)藏的有價(jià)值的信息,從中尋找具有新型酶學(xué)性質(zhì)的基因資源,已引起酶學(xué)研究者的注意并進(jìn)行了積極探索。此外,充分挖掘基因組信息,建立起對(duì)應(yīng)的高通量定向篩選技術(shù),可以極大地提高特定產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選效率。常規(guī)的選擇性培養(yǎng)基篩選產(chǎn)脂肪酶微生物,常常因?yàn)槟承┪⑸镉捎诓皇黔h(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌群而漏篩。本實(shí)驗(yàn)室充分挖掘Burkholderiasp.菌株的基因組信息,建立起一種針對(duì)產(chǎn)脂肪酶Burkholderiasp.菌株的高通量定向的篩選技術(shù),從常規(guī)環(huán)境(油料植物根際)中快速批量篩選到24株具有廣譜有機(jī)溶劑耐受性的Burkholderiasp.菌株(未發(fā)表數(shù)據(jù),相關(guān)文章正在整理之中)。4脂肪酶的功能蛋白質(zhì)工程技術(shù)手段更新和發(fā)展層出不窮。在生物信息學(xué)、生物物理和量子化學(xué)等學(xué)科知識(shí)的支持下,各種理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化技術(shù)廣泛應(yīng)用于對(duì)微生物脂肪酶分子的改造和優(yōu)化中,獲得了一系列新型的微生物脂肪酶資源,包括提高脂肪酶的脂(酯)解活性、酰胺水解活性、磷脂水解活性、醇解活性、醛縮反應(yīng)活性和對(duì)映體拆分活性;提高脂肪酶的溫度穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性和對(duì)氧化劑的耐受性;改變底物的鏈長(zhǎng)選擇性、最適作用溫度和最適作用pH,擴(kuò)大脂肪酶的可接受底物譜范圍等。表2簡(jiǎn)要列舉了利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)脂肪酶不同性質(zhì)的改造情況。利用蛋白質(zhì)工程改造和優(yōu)化脂肪酶的關(guān)鍵技術(shù)主要有兩點(diǎn)：(1)建立起與特定脂肪酶基因?qū)?yīng)的表達(dá)體系。不同脂肪酶分子形成活性構(gòu)象及激活需要不同的條件,因此脂肪酶突變庫(kù)基因表達(dá)系統(tǒng)的選擇需要因基因而異。(2)針對(duì)脂肪酶的不同催化活性,建立起對(duì)應(yīng)的高通量篩選技術(shù)平臺(tái)。Tielmann利用傅立葉紅外光譜建立起脂肪酶對(duì)映體拆分活性的高通量篩選技術(shù),每天可以完成20000個(gè)轉(zhuǎn)化子的篩選工作。5資源外預(yù)處理除了上述篩選、挖掘新型脂肪酶基因資源或產(chǎn)脂肪酶菌株資源外,對(duì)現(xiàn)有脂肪酶進(jìn)行固定化處理或化學(xué)修飾處理,可以極大地改變現(xiàn)有脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)和催化性質(zhì),獲得新型的脂肪酶酶制劑。5.1細(xì)胞表面展示技術(shù)酶的固定化技術(shù)朝兩個(gè)方向發(fā)展：新材料和新方法的應(yīng)用。在各種新型固定化材料中,以納米材料的固定化效果尤為引人注意。Dyal和deLathouder分別用γ-Fe2O3納米顆粒和碳納米管固定Candidarugosa脂肪酶和Candidaantarctica脂肪酶,在反應(yīng)器中的穩(wěn)定性超過(guò)1個(gè)月之久。而Persson用sol-gel形成的納米顆粒包埋Humicolalanuginosa脂肪酶,脂肪酶的比活力提高了320倍。在脂肪酶固定化方法方面,細(xì)胞表面展示技術(shù)作為一種新型的固定化技術(shù),使全細(xì)胞生物催化劑的催化效率逐步提高并逐步應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。到目前為止,包括S.carnosus、B.subtilis、P.putida、S.cerevisiae、P.pastoris、E.coli在內(nèi)的各種細(xì)胞表面展示技術(shù)均已應(yīng)用于脂肪酶的固定化。Shiraga用S.cerevisiae細(xì)胞表面展示R.oryzae脂肪酶導(dǎo)致脂肪酶的水解活性和酯化活性分別提高了4.4×104倍和3.8×104倍。5.2脂肪酶分子的合成及活性提高相比通過(guò)分子進(jìn)化技術(shù)改造脂肪酶分子而言,化學(xué)修飾技術(shù)對(duì)脂肪酶分子的側(cè)鏈幾乎可以進(jìn)行無(wú)窮無(wú)盡的設(shè)計(jì)和改造。常見(jiàn)的脂肪酶分子的化學(xué)修飾技術(shù)包括：利用小分子化合物(如氨基葡萄糖)對(duì)脂肪酶活性部位或活性部位之外的側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾、雙功能或多功能交聯(lián)劑(如戊二醛)共價(jià)交聯(lián)脂肪酶分子、形成交聯(lián)酶晶體及單功能試劑(如聚乙二醇及其衍生物)的化學(xué)修飾等。脂肪酶分子的化學(xué)修飾可以顯著增強(qiáng)脂肪酶分子的穩(wěn)定性、提高(或改變)脂肪酶分子的活性。Siddiqui采用多糖修飾Candidaantarctica脂肪酶B后,脂肪酶70°C的半衰期由18min提高到168min。Ueji和Palomo分別用芐氧羰基和乙二胺修飾C.rugosa脂肪酶和Cantarctica脂肪酶B,脂肪酶對(duì)映體拆分的活性分別提高了15倍和50倍。本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行黑曲霉脂肪酶基因畢赤酵母異源表達(dá)時(shí),也觀察到糖基化側(cè)鏈修飾對(duì)脂肪酶的性質(zhì)(尤其是比活力)有顯著影響。6微生物脂肪酶的市場(chǎng)需求和應(yīng)用領(lǐng)域作為一種非水相酶,微生物脂肪酶在精細(xì)化工、有機(jī)合成等諸多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用潛力和市場(chǎng)價(jià)值