第十二章遺傳工程

第十二章遺傳工程

第一節(jié)遺傳工程概述第二節(jié)基因的分離第三節(jié)外源基因的導(dǎo)入

第四節(jié)轉(zhuǎn)基因生物的檢測與鑒定第五節(jié)基因工程的應(yīng)用1制作：夏海武第一節(jié)遺傳工程概述★遺傳工程，也稱生物工程，是指利用工程技術(shù)的方法改造和修飾生物體，使其產(chǎn)生新的性狀或產(chǎn)品，從而改良生物體的一種遺傳學(xué)手段。廣義的遺傳工程包括細胞工程、基因工程、酶工程和發(fā)酵過程等。狹義的遺傳工程即是通常講的基因工程。本章只介紹基因工程?！锘蚬こ讨械腄NA重組主要是指創(chuàng)造自然界中沒有的DNA分子的新組合。這種重組不同于經(jīng)典遺傳學(xué)中經(jīng)過遺傳交換產(chǎn)生的重組?；蚬こ淌遣捎梅肿由飳W(xué)、核酸生物化學(xué)以及微生物遺傳學(xué)的現(xiàn)代方法和手段建立起來的基因操作技術(shù)。2制作：夏海武一、細胞工程：

是指在離體條件下，對生物細胞進行培養(yǎng)、繁殖，或使其發(fā)生某種改變，從而達到改良生物品種或創(chuàng)造新品種，加速繁育動植物體，或利用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)的過程。細胞工程包括：細胞培養(yǎng)、細胞融合、細胞器轉(zhuǎn)移、生物體的克隆與快繁等。二、酶工程：

是利用酶催化的作用，在一定的生物反應(yīng)器中，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所需要的產(chǎn)品。三、發(fā)酵工程：

將微生物的生長速度快、生長條件簡單及代謝過程特殊等特點，與現(xiàn)代化工程技術(shù)結(jié)合起來，在生物的反應(yīng)器中生產(chǎn)有用物質(zhì)的一種技術(shù)系統(tǒng)。3制作：夏海武

是利用人工的方法把生物的遺傳物質(zhì)在體外進行切割、拼接和重組，獲得重組DNA分子，然后導(dǎo)入宿主細胞或個體，使受體的遺傳特性得到修飾或改變的過程?！飶募毎徒M織中分離DNA?！锢媚茏R別特異DNA序列的限制性內(nèi)切核酸酶(restrictionendonucleases)酶切DNA分子，制備DNA片段?！飳⒚盖械腄NA片段與載體DNA連接，構(gòu)建重組DNA分子。★將載體與DNA片段構(gòu)成的重組DNA分子導(dǎo)入宿主細胞后，該重組DNA分子能在細胞內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生多個完全相同的拷貝，即克隆(clones)?！镏亟MDNA能隨宿主細胞的分裂而分配到子細胞，使子代群體細胞均具有重組DNA分子的拷貝?！锬軓乃拗骷毎谢厥?、純化和分析克隆的重組DNA分子。★克隆的DNA能轉(zhuǎn)錄成mRNA、翻譯成蛋白質(zhì)。能分離、鑒定基因產(chǎn)物。

四、基因工程4制作：夏海武目的基因的獲得目的基因與載體的連接成重組DNA分子重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞篩選重組克隆基因表達與產(chǎn)物分離基因工程的內(nèi)容基因工程概述5制作：夏海武重

組

DNA

技

術(shù)基因工程概述6制作：夏海武第二節(jié)基因的分離一、工具酶（一）限制性內(nèi)切核酸酶

★限制性內(nèi)切核酸酶或限制性酶(restrictionenzymes)：在細菌中這些酶的功能是降解外來DNA分子的一類酶，以限制(restriction)或阻止病毒侵染。★限制性酶據(jù)其作用特點，可分為三種類型：

※第Ⅰ類限制性酶每隔一段DNA序列隨機切割雙鏈DNA分子，沒有序列特異性。

※第Ⅱ類限制性酶能識別一段特異的DNA序列，準(zhǔn)確地酶切雙鏈DNA的特異序列。

※第Ⅲ類限制性酶具有特異的識別位點，這種酶的識別位點是非對稱的。7制作：夏海武限制性核酸內(nèi)切酶的類型及其主要特性

特性1.限制修飾活性2.內(nèi)切酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3.限制輔助因子4.切割位點5.特異性切割6.基因克隆中

I型雙功能的酶3種不同亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特異性位點5‘端至少1000bp不是（隨機）無用

II型限制酶和修飾酶分開單一成分Mg2+位于識別位點上是非常有用

III型雙功能酶2種亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特異性位點3‘端24-26bp處是用處不大8制作：夏海武II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特點1、識別位點的特異性

每種酶都有其特定的DNA識別位點，通常是由4～8個核苷酸組成的特定序列（靶序列）。2、識別序列的對稱性

靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。3、切割位點的規(guī)范性

交錯切或?qū)ΨQ切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。9制作：夏海武限制性內(nèi)切核酸酶

10制作：夏海武限制性內(nèi)切核酸酶11制作：夏海武幾種II型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

12制作：夏海武平齊末端帶5’－P端的黏性末端帶3’－OH和5’－P端的平末端13制作：夏海武（二）DNA連接酶

環(huán)形DNA分子的發(fā)現(xiàn)使科學(xué)家相信一定有一種能連接這種切口的酶存在。

首個DNA連接酶(ligase)——1967年，大腸桿菌DNA連接酶，是大腸桿菌基因編碼

。1970年，發(fā)現(xiàn)了T4DNA連接酶，由大腸桿菌T4噬菌體基因編碼的。14制作：夏海武DNA連接酶作用的特點A.連接的兩條鏈必須分別具有自由3’－OH和5’－P，而且這兩個基團彼此相鄰；B.在羥基和磷酸基團間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過程。E.coliDNA連接酶－連接具互補堿基黏性末端(最初研究表明），現(xiàn)在研究可連接平末端；需NAD+輔助因子，活性低，不常用。T4DNA連接酶－連接具互補堿基黏性末端和平末端，需ATP輔助因子，活性高，常用。15制作：夏海武

是兩條鏈－因此不能將兩條單鏈連接起來或使單鏈環(huán)化起來。

OHP××是相鄰的－因此不能封閉gap，只能封閉nick.gapNONickOK16制作：夏海武

（三）

反轉(zhuǎn)錄酶—Reversetranscriptase反轉(zhuǎn)錄酶是一種依賴RNA的DNA聚合酶。此酶首先是1970年從鼠白血病毒和勞氏肉瘤病毒中發(fā)現(xiàn)的。這兩個課題組的論文都發(fā)在了同一期的《Nature》雜志上。最普遍使用的是從鳥類骨髓母細胞瘤病毒（AMV）分離出來的?；钚裕阂环N可以有效地將mRNA反轉(zhuǎn)錄成DNA的酶，其產(chǎn)物稱為cDNA(complementaryDNA).主要用途是將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA以制備基因片段。3’AAAAAAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5’TTTTTTTTT3’AAAAAAAA

堿水解反轉(zhuǎn)錄酶＋oligo(dT)帶poly(A)的mRNAcDNASI核酸酶DNA聚合酶17制作：夏海武（四）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）的方法始于20世紀(jì)70年代早期，由Khorana和他的同事最先提出的建義。在1983年，美國Cetus公司人類遺傳研究室的科學(xué)家K.B.Mullis發(fā)明的。PCR是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，有稱之為體外擴增法。18制作：夏海武1.PCR技術(shù)的基本成分

PCR的成分包括：待擴增的模板引物DNA聚合酶四種脫氧核苷酸的混合物反應(yīng)緩沖液。模板是含有待擴增序列的DNA或從mRNA反轉(zhuǎn)錄來的cDNA。19制作：夏海武TaqDNA聚合酶CharacteristicsofTaqPolymerase

20制作：夏海武PCR的引物

是指與待擴增的靶DNA區(qū)段兩端序列互補的人工合成的寡核苷酸片斷。21制作：夏海武2.PCR技術(shù)的原理和過程

94726022制作：夏海武溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復(fù)始，重復(fù)進行，直至擴增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實驗需求為止。23制作：夏海武24制作：夏海武PCR擴增過程中片段增殖的計算25制作：夏海武PCR反應(yīng)體系的確立WaterBuffer（10×）Mg++（25mM）dNTPs（10mM）Primer1（10uM）Primer2（10uM）Taq（5U/uL）Templets12.821.60.4110.2120uL反應(yīng)體系中各成分的母液濃度及加入量PCR擴增程序舉例Tem.94℃94℃60℃72℃72℃Time00:08:0000:00:3000:00:4000:01:0000:07:00Cycles――30――26制作：夏海武3.PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測圖M1234567MM,marker;1-2,PCRforCP4-EPSPSgene;3-4,PCRfor35SPromoter;5-6,PCRforlectingene;7,Negtivecontrol.27制作：夏海武二載體

一個DNA片段只有與適合的載體(vector)DNA連接構(gòu)成重組DNA后，在載體DNA的運載下，才可以高效率地進入宿主細胞(hostcell)，并在其中復(fù)制、擴增、克隆出多個拷貝?？勺鳛镈NA載體的有質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細菌或酵母菌人工染色體（BAC、YAC）等。作為載體DNA分子，需要具備以下四個條件：★具復(fù)制原點(ori)，在宿主細胞中不僅能獨立地自我復(fù)制，而且能帶動攜帶的外源DNA片段一起復(fù)制?！锞哂卸嗫寺∥稽c(multiplecloningsite,MCS)，而每一種酶的切點只有一個，用于克隆外源DNA片段。這些酶切位點不存在于復(fù)制原點或抗性選擇標(biāo)記基因內(nèi)?！镏辽倬哂幸粋€選擇標(biāo)記基因，使有或無載體的宿主細胞具有易鑒別的表型。★相對分子質(zhì)量小，多拷貝，易于操作。

28制作：夏海武1.質(zhì)粒載體◆質(zhì)粒是細菌細胞內(nèi)獨立于細菌染色體而自然存在的、能自我復(fù)制、易分離和導(dǎo)入的環(huán)狀雙鏈DNA分子?！钸@些質(zhì)粒的適應(yīng)范圍廣，拷貝數(shù)多。進入宿主細胞復(fù)制后，每個細胞的質(zhì)?？截悢?shù)可高達1000個?！粼缙谟糜诨蚬こ痰妮d體是經(jīng)遺傳改良的細菌質(zhì)粒，它們僅能用于克隆分子量小于10kb(1000bp=1kb)的外源DNA片段?！瞵F(xiàn)在廣泛使用且商品化的質(zhì)粒，很多都具有重組表型檢測標(biāo)記，在DNA克隆中根據(jù)宿主細胞的表型即可推知質(zhì)粒是否攜帶外源DNA片段。

29制作：夏海武2.病毒菌體

◆λ噬菌體基因組全長48kb。λ噬菌體DNA中間約三分之二的序列為中間基因簇(centralgenecluster)，位于兩端的為DNA左、右臂。λ基因組的中間基因簇序列可被外源DNA片段取代,而不影響噬菌體感染細菌及形成噬菌斑的能力。◆λ噬菌體載體可接受15kb-23kb的外源DNA片段，它既可作為克隆載體，也可作為表達載體，在基因庫篩選中，λ噬菌體作載體與細菌質(zhì)粒相比，具有易操作、陽性克隆數(shù)多等特點，現(xiàn)廣泛用于各類基因庫的構(gòu)建。

30制作：夏海武3.克隆大片段DNA的載體——細菌人工染色體

◆

BAC載體是基于細菌的性因子(F因子)質(zhì)粒的一些特點構(gòu)建的。F因子是細菌細胞內(nèi)能自我復(fù)制的質(zhì)粒，約100kb，它能在細菌接合時轉(zhuǎn)移1000kb的細菌染色體片段。將F因子經(jīng)基因工程改良構(gòu)成的BAC載體，可用于克隆100kb以上的DNA片段。◆帶有外源片段的BAC載體在細菌細胞中通常僅單個拷貝，這一特點有利于保持DNA大分子，尤其是重復(fù)序列多的DNA大分子，在細胞內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制而不發(fā)生重組。BAC載體本身分子量小，僅帶有自我復(fù)制、控制拷貝數(shù)(repE)及質(zhì)粒分配(parE，parA,parB)所必須的最少序列，可以插入大的DNA片段。BAC載體還具有氯霉素抗性選擇基因及多克隆位點。31制作：夏海武32制作：夏海武酵母人工染色體◆酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）是另一類酵母穿梭載體。同穿梭載體（YEp載體）一樣具有自主復(fù)制序列、克隆位點以及可在細菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因。YAC還具有酵母菌染色體的一些特點。YAC可以接受100-1000kb的外源DNA片段，這一特點使YAC成為人類基因組計劃及圖位克隆分離基因的重要工具，并促進了發(fā)展人類人工染色體(humanartificialchromosome，HAC)的研究。33制作：夏海武三、基因分離方法

(一)基于基因文庫的基因分離方法（二）T-DNA標(biāo)簽克隆基因

(三)基于PCR的基因克隆(四)人工合成基因

34制作：夏海武1.構(gòu)建基因庫

基因庫(library)是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。從基因庫中分離基因，首先要構(gòu)建基因庫。只有利用合乎要求的基因庫才有可能篩選出所需要的基因，很多分子遺傳學(xué)工作才能繼續(xù)深入下去?；蚪M文庫

◆基因組文庫是將某一生物的全部基因組DNA酶切后與載體連接構(gòu)建而成的。

◆通常的方法是，盡量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分離選擇具有一定長度(大于15kb)的DNA片段，與適宜的載體(如EMBL)連接構(gòu)成重組DNA分子，根據(jù)所用的載體，選擇相應(yīng)的宿主細胞用于克隆。這個克隆群體中包含有全部基因組DNA信息。(一)基于基因文庫的基因分離方法35制作：夏海武(2)cDNA庫

◆

cDNA庫是以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)合成互補DNA(complementaryDNA，cDNA)構(gòu)建的基因庫?！艚^大多數(shù)真核生物mRNA的3′端具有一段多聚A(poly-A)尾端序列。利用一段多聚T(poly-T)為引物(primer)，與poly-A互補配對，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，用poly-T引物引導(dǎo)合成一條互補DNA，即第一條DNA鏈，結(jié)果形成RNA-DNA雜合雙鏈(圖9－10)。然后合成第2條鏈?！魧]有poly-A尾端序列的RNA分子，可用寡聚六苷酸(hexamer)為引物合成第一條鏈，再用上述方法得到雙鏈DNA。36制作：夏海武◆得到的雙鏈DNA分子經(jīng)兩端補齊后，以與帶有限制性酶切點的人工接頭連接，酶切后與載體(通常是λ噬菌體)連接，再制備cDNA庫。◆

cDNA庫僅具有用于分離mRNA的細胞或組織內(nèi)表達的基因的mRNA序列，所以它僅包括基因組的部分基因序列?！粼趯嶋H工作中，構(gòu)建什么樣的基因庫取決于研究目的。cDNA庫對于研究基因的表達模式、分離某一特定基因是十分有用的。如果要分離在某一細胞或組織高效表達的某種基因，可用該細胞或組織的mRNA構(gòu)建cDNA庫，則很容易得到這個基因。◆通常是將cDNA庫與核基因庫配合使用，以便既能得到基因的編碼序列，又可得到基因的調(diào)控序列。cDNA庫

37制作：夏海武2.從基因庫

中分離特定基因◆從基因庫中篩選、分離基因，可根據(jù)對待選基因相關(guān)信息的了解程度，確定篩選方法和條件?！舸蠖鄶?shù)方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸)作探針(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針，也可用抗體作探針，篩選基因庫?！羧缇唠s交法(plaquehybridization)篩選λ噬菌體核基因庫。38制作：夏海武3.序列測定和分析39制作：夏海武（二）T-DNA標(biāo)簽法

此法是根據(jù)Ti質(zhì)粒上的T-DNA能完全整合到植物的核基因組上，且根據(jù)目前的實驗結(jié)果，一般認(rèn)為T-DNA在植物核基因組中的插入位置是隨機的。在T-DNA標(biāo)簽法中，將T-DNA插入任何感興趣的基因處產(chǎn)生插入性突變，以獲得分析該基因功能的對照突變體。它將T-DNA左右邊界之間攜帶的外源報告基因片段作為一個選擇性的遺傳標(biāo)記，因為插入的序列是已知的，因而對獲得的轉(zhuǎn)基因重組突變體就可以通過各種克隆和PCR策略加以研究。40制作：夏海武（三）基于PCR的基因克?。ㄋ模┗虻娜斯ず铣?1制作：夏海武第三節(jié)外源基因的導(dǎo)入一、重組DNA導(dǎo)入原核生物氯化鈣處理轉(zhuǎn)化取1mL菌液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，冰上放置10min，然后于4℃下3000g離心10min。棄去上清，用預(yù)冷的0.05mol/L的CaCl2溶液1mL輕輕懸浮細胞，冰上放置15-30min后，4℃下3000g離心10min。棄去上清，加入200μL預(yù)冷含15%甘油的CaCl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細胞懸液。加入5μL連接產(chǎn)(含量不超過50ng，體積不超過10μL)，輕輕搖勻，冰上放置30min。42