江南卷柏不同部位提取物對hep-2細(xì)胞抗柯薩奇病毒活性的影響

江南卷柏不同部位提取物對hep-2細(xì)胞抗柯薩奇病毒活性的影響

coxsacki病毒是重癥監(jiān)護(hù)病毒科的腸道毒素。感染于人類，與各種人類疾病密切相關(guān)。例如，病毒性胃炎、慢性胰腺、慢性疲勞綜合征、晚性腎炎、心率障礙和i型糖尿病。其中，rcb3是病毒性心力衰竭的主要原因。由于缺乏有效的治療藥物,許多患者演變?yōu)槁詳U(kuò)張性心肌病,最后死于心力衰竭。江南卷柏為卷柏科植物江南卷柏SelaginellamoelledorfiiHieron的全草,具有涼血止血,清熱利濕的功效,民間用來治療肝炎、各種內(nèi)外出血等疾病。以江南卷柏為原料制得的江南卷柏片治療原發(fā)性血小板減少性紫癜、繼發(fā)性血小板減少性紫癜以及多種出血性疾病,有較好作用?！稄V西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》將其作為石上柏的原植物之一收載,用于癌癥及多種炎癥的治療。江南卷柏所含化學(xué)成分以雙黃酮類為主,主要含穗花杉雙黃酮。穗花杉雙黃酮具有抗腫瘤,抗病毒,血管舒張作用。在抗病毒篩選研究中,發(fā)現(xiàn)江南卷柏具有較強的抗柯薩奇病毒的活性,本實驗深入比較其不同提取部位抗CVB3病毒的強度,以確定其抗CVB3病毒的主要活性部位。1材料表面1.1黃酮苷的提取江南卷柏的全草采集于湖北宜昌霧渡河,原植物經(jīng)湖北中醫(yī)學(xué)院陳科力教授鑒定。將采集的江南卷柏植物材料曬干,去除雜質(zhì),粉碎成粗粉。稱取粗粉50.0g,首先用石油醚脫脂,再用95%乙醇回流提取3次,濾過,合并濾液,濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收溶劑后干燥,此干膏先以醋酸乙酯萃取,再以正丁醇萃取。將醋酸乙酯萃取液回收溶劑后干燥,編號為1號(醋酸乙酯部位)。將1號(醋酸乙酯部位)溶于低濃度乙醇溶液,以大孔樹脂純化,回收乙醇后干燥,編為2號(脂溶性總雙黃酮部位),含量測定表明,2號含總黃酮以穗花杉雙黃酮計達(dá)50%以上,其中穗花杉雙黃酮的含量占總黃酮的80%以上。3號為穗花杉雙黃酮,為本實驗室提取純化制得。在高效液相色譜上與穗花杉雙黃酮對照品(購自武漢生物藥品檢定所)對照,用歸一法計算得其純度為97%。將正丁醇萃取部分回收溶劑后干燥,編為4號(正丁醇部位),該部位經(jīng)分析含有多種水溶性黃酮苷。陽性藥物阿昔洛韋編號為A號。1.2小鼠血清和mttRPMI-1640(GIBCO,批號SH3032707);小牛血清(三利生物制品廠,批號070306);MTT(噻唑蘭,AMRESCO,批號M1124);阿昔洛韋(武漢長聯(lián)來福生化藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號20070421C)。1.3細(xì)胞生長液Hep-2細(xì)胞,由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病毒所保存。細(xì)胞生長液為RPMI-1640,加新生牛血清至10%。細(xì)胞維持液為RPMI-1640,加新生牛血清至2%。1.4凍融3次,2細(xì)胞增殖CVB3(Nancy株),由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病毒所保存。病毒經(jīng)Hep-2細(xì)胞活化增殖,細(xì)胞病變達(dá)75%以上時收獲,反復(fù)凍融3次,3000r·min-1離心30min,上清液分裝后-20℃保存?zhèn)溆?。在Hep-2細(xì)胞上測定其病毒滴度為10-7。實驗中使用的感染劑量為10-5。2方法2.1mtt法檢測細(xì)胞活性取已經(jīng)生長成單層Hep-2細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板,棄去培養(yǎng)液,分別加入1號～4號不同質(zhì)量濃度的6.25,12.5,25,50,100,200,400mg·L-1的藥物培養(yǎng)液,37℃培養(yǎng)72h,每12h觀察細(xì)胞形態(tài),并與正常細(xì)胞作對照,每一藥物劑量均重復(fù)4孔,MTT法檢測細(xì)胞活性,確定藥物的無毒劑量。2.2細(xì)胞毒性實驗根據(jù)病毒的復(fù)制周期,設(shè)計藥物抗病毒作用的3種途徑,分3個處理組,同時根據(jù)藥物細(xì)胞毒性實驗的結(jié)果,在半數(shù)毒性濃度之內(nèi)確定5個終濃度,以這5種濃度的藥物培養(yǎng)液進(jìn)行實驗。每一個處理組都設(shè)立病毒對照組、陽性藥物對照組和正常細(xì)胞對照組,這3種對照組與處理組同時同法操作。2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)液制備將不同濃度的藥物培養(yǎng)液100μL加入生長完好的單層Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)板中,37℃孵育2h后,棄去含藥培養(yǎng)液,再加入100μL病毒液,37℃孵育2h后,棄去病毒液,再加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng),觀察。2.2.2單層hep-2細(xì)胞培養(yǎng)將不同濃度的藥物培養(yǎng)液100μL和病毒液100μL混合,37℃孵育2h后,再加入生長完好的單層Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)板中,37℃孵育2h后,棄去含藥與病毒培養(yǎng)液,再加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng),觀察。2.2.3細(xì)胞生長和細(xì)胞病變效應(yīng)檢測將100μL病毒液加入生長完好的單層Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)板中,37℃孵育2h后,棄去病毒液,再加入不同濃度的藥物維持液繼續(xù)培養(yǎng)。以上3個處理組在37℃繼續(xù)培養(yǎng)72～120h,參照正常細(xì)胞對照組、病毒對照組,每天觀察細(xì)胞生長情況及相應(yīng)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)程度。當(dāng)病毒對照組出現(xiàn)75%以上典型CPE時采用MTT法檢測細(xì)胞活性。2.3體外藥物抑制cvb3活性細(xì)胞存活率%=藥物組平均吸光度(OD)值/細(xì)胞對照組平均OD值×100%。病毒抑制率%=(藥物組平均OD值-病毒對照組平均OD值)/(正常細(xì)胞對照組OD值-病毒對照組OD值)×100%。半數(shù)細(xì)胞毒性濃度TC50為使藥物組OD值比正常細(xì)胞對照組降低50%的藥物濃度;半數(shù)病毒抑制濃度IC50為保護(hù)50%的細(xì)胞免受病毒破壞的藥物組濃度,用SPSS11.5軟件來計算。采用治療指數(shù)(TI)作為評價指標(biāo)來衡量藥物對CVB3的抑制效力。TI=TC50/IC50。TI值越大,表明藥物抑制CVB3的作用越強。3結(jié)果3.1阿氏洛韋對正丁醇部位和穗花杉雙黃酮的細(xì)胞毒性檢測不同藥物樣品作用于Hep-2細(xì)胞72h后,用MTT法測定細(xì)胞活性。結(jié)果顯示:正丁醇部位對細(xì)胞的毒性最小,穗花杉雙黃酮對細(xì)胞的毒性最大。對照藥物阿昔洛韋在實驗濃度范圍內(nèi)沒有測出細(xì)胞毒性。不同藥物的細(xì)胞毒性高低排列為4號<1號<2號<3號,其TC50值見表1。3.2抗黃疸病毒的藥物作用3.2.1結(jié)果與分析試驗結(jié)果不同濃度的各種藥物與細(xì)胞事先作用2h后,接種病毒,結(jié)果以上藥物都沒有顯現(xiàn)出對感染CVB3細(xì)胞的保護(hù)作用,各孔細(xì)胞均出現(xiàn)典型的病毒病變,細(xì)胞生長紊亂,細(xì)胞變圓或細(xì)長,顆粒增多,折光性增加,最后脫落死亡。3.2.2阿被死藥物的效力藥物和病毒直接作用后再感染細(xì)胞。結(jié)果顯示:以上藥物都具有直接殺死CVB3病毒的效力,作用明顯。而陽性藥物阿昔洛韋直接殺死病毒的效力較弱。各提取物在有效濃度范圍內(nèi)最高病毒抑制率見圖1;各提取物殺死病毒的IC50見表2;其治療指數(shù)TI值比較見圖2。3.2.3內(nèi)生物合成的效力在本實驗中,各提取物都顯示出具有較強的抑制CVB3病毒在細(xì)胞內(nèi)生物合成的效力。而陽性藥物阿昔洛韋沒有抑制CVB3病毒在細(xì)胞內(nèi)生物合成的效力。各提取物在有效濃度范圍內(nèi)最高病毒抑制率見圖3;各提取物殺死病毒的IC50見表3;其TI值比較見圖4。4抗cvb3病毒的作用機(jī)制由CVB3感染引起心肌病變主要是病毒直接侵犯心肌細(xì)胞,從而引發(fā)一系列免疫因素對心肌的損傷所致。目前國內(nèi)外尚無有效的治療方法。本研究發(fā)現(xiàn)江南卷柏提取物能減輕CVB3病毒感染細(xì)胞CPE的程度,抑制CVB3病毒的效力,并且其細(xì)胞毒性較小。本實驗從3個方面初步探討了江南卷柏提取物抗CVB3病毒的作用機(jī)制。結(jié)果顯示:江南卷柏提取物具有抑制CVB3病毒生物合成的作用和直接殺死病毒的作用,其抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行生物合成的效力比直接殺死CVB3的效力要強。實驗結(jié)果顯示,4號正丁醇提取部位對病毒的抑制率與1號醋酸乙酯提取部位和2號總雙黃酮提取物基本相同,但因其較低的細(xì)胞毒性,所以有較高的治療指數(shù)。正丁醇提取部位主要含有水溶性的黃酮苷類。實驗發(fā)現(xiàn)江南卷柏總黃酮提取物對病毒直接作用的IC50和抑制病毒生物合成作用的IC50均小于醋酸乙酯提取部