分子標(biāo)記在植物線蟲學(xué)的應(yīng)用

分子標(biāo)記技術(shù)在植物線蟲學(xué)的應(yīng)用張衛(wèi)東1廖力1蔣立琴2徐淼鋒1陳其文1(1.珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局519０152。珠海市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局）分子標(biāo)記是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記之后發(fā)展起來的一種新型的遺傳標(biāo)記形式,它以核酸分子的突變?yōu)榛A(chǔ),是直接在DNA分子上檢測(cè)生物間的差異,是以檢測(cè)生物個(gè)體在基因或基因型上所產(chǎn)生的變異來反映生物個(gè)體之間的差異[１～3］.DＮA分子標(biāo)記能對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的個(gè)體、任何組織器官甚至細(xì)胞作檢測(cè),不受環(huán)境及基因表達(dá)與否的限制，具有多態(tài)性高,遺傳穩(wěn)定,檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、快速，檢測(cè)結(jié)果客觀準(zhǔn)確等特點(diǎn),可以彌補(bǔ)和克服在形態(tài)學(xué)鑒定及同工酶、蛋白電泳鑒定中的許多缺陷和難題.因而，DNA分子標(biāo)記技術(shù)自1974年Grｏｄzｉｃker創(chuàng)立RFLP技術(shù)以來,各種新型標(biāo)記相繼問世，并逐漸滲透到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。在植物檢疫學(xué)科中，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已成功應(yīng)用于植物病原真菌、細(xì)菌、昆蟲和線蟲等的研究中[4～8]。本文就分子標(biāo)記在植物病原線蟲學(xué)的應(yīng)用作一綜述.1分子標(biāo)記技術(shù)在植物線蟲學(xué)的應(yīng)用１.1限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Resｔrictionfraｇｍｅntpｏlymｏrpｈismｓ，ＲFＬＰ）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFＬＰ，ｒeｓtrｉｃtｉonｆragmentlengtｈpoｌymorpｈｉｓm)是最早發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)之一［9].其原理是對(duì)特定的DNA片段的限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物進(jìn)行分析，根據(jù)片段的大小不同以及標(biāo)記片段種類和數(shù)量的不同,從而分析在同源序列上產(chǎn)生的ＤNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性差異。此技術(shù)及其從中發(fā)展起來的一些變型均包括以下基本步驟:ＤNA的提取、用限制性內(nèi)切酶酶切DＮＡ、用凝膠電泳分開DNＡ片段、把DＮA片段轉(zhuǎn)移到濾膜上、利用放射性標(biāo)記的探針顯示特定的DNA片段(通過Soｕtherｎ雜交）和分析結(jié)果。二十世紀(jì)八九十年代,該方法在植物線蟲學(xué)中應(yīng)用較多。如1９86年Curran首先用該技術(shù)成功區(qū)分了Triｃhineｌｌa和根結(jié)線蟲（Melｏidogｙｎe）；Burrows和Bｏｆfey用該技術(shù)區(qū)分了馬鈴薯金線蟲（Gｌoｂodeｒaｒoｓｔｏｃｈieｎsｉs)及馬鈴薯白線蟲(Ｇ。palliｄa）；Bolｌa等應(yīng)用RＦLP方法區(qū)分了松材線蟲與擬松材線蟲;Wｅbster等構(gòu)建了松材線蟲的基因文庫(kù)，從中篩選了來自rDNA的內(nèi)切酶片段，并正確區(qū)分了不同來源的松材線蟲與日本和歐洲的擬松材線蟲[１0~13］。RＦＬP標(biāo)記的具有重復(fù)性好、穩(wěn)定性高和共顯性遺傳等特點(diǎn)。但是,ＲFLＰ分析操作過程中涉及了DNA的提取、酶切、電泳分離、探針的制備和Ｓouｔheｒn雜交等一系列分子生物學(xué)技術(shù)，步驟繁雜，工作量大，而且對(duì)DＮA的需求量很大,檢測(cè)多態(tài)性頻率較低，特別是放射性同位素及核酸雜交技術(shù)，既不安全又不易自動(dòng)化。因此很大程度上限制了該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用，已逐漸被其他新型標(biāo)記所替代。1。2隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RandomａmpｌｉfｉedpolymoｒphismDNA，RAPＤ）RAPD技術(shù)是由Ｗilｌiaｍs等（1９90）發(fā)明的一種新的分子標(biāo)記技術(shù)，基本原理是利用一系列不同的堿基隨機(jī)排列的寡聚核苷酸單鏈作為引物對(duì)所研究的基因組DＮＡ進(jìn)行ＰＣR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離，ＥB顯色或放射性自顯影來檢測(cè)擴(kuò)增DＮA片段的多態(tài)性,這些擴(kuò)增的ＤＮA片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的ＤNA多態(tài)性［１４］.ＲAPＤ反應(yīng)引物是隨機(jī)排列的，無(wú)須專門設(shè)計(jì)，引物較短，可以在對(duì)物種沒有任何分子生物學(xué)研究的情況下,構(gòu)建基因組的指紋圖譜，通過統(tǒng)計(jì)分析為物種進(jìn)化和分類提供DNA水平上的理論依據(jù)，對(duì)于種、亞種、變種的鑒別與演化關(guān)系的研究具有重要意義。Irdani等（1995）、Brａasch和Burgｅrｍeｉsｔer（199５)、鄭經(jīng)武等(1９98)、汪來發(fā)等(２001）用ＲAPD技術(shù)成功的區(qū)分了松材線蟲與擬松材線蟲［15～18］。此外張路平等（２０0２)對(duì)松材線蟲與擬松材線蟲的線粒體DNA進(jìn)行了RAPD分析，將松材線蟲的群體分成日本株系與北美洲株系[19]。Ａｍiri等（2003)應(yīng)用RAＰD技術(shù)構(gòu)建了區(qū)分甜菜胞囊線蟲（H.sｃhachtii)和H.betae的圖譜［２0］;Cａｒneｉro等（2０04）利用ＲＡＰD技術(shù)對(duì)來自巴西、美國(guó)咖啡上的根結(jié)線蟲進(jìn)行遺傳學(xué)變異分析[21］；Lax等（２00４）首次對(duì)來自阿根廷的大豆胞囊線蟲（Heｔerｏｄｅｒａｇlyciｎes)進(jìn)行了RAPD分析,指出兩群體間存在明顯的遺傳學(xué)差異,并分析可能是由于基因漂移或不同管理措施所造成的結(jié)果［2２］。此外,RAＰD標(biāo)記成功應(yīng)用于鱗球莖線蟲（Dｉtylｅｎchuｓdｉｐsacｉ）、馬鈴薯金線蟲與白線蟲等［2３~２4]。ＲＡPD技術(shù)是一種優(yōu)于ＲFLＰ技術(shù)的DNA分子標(biāo)記方法,具有效率高、樣品用量少、靈敏度高、成本較低和檢測(cè)容易等優(yōu)點(diǎn)。但是ＲAＰD技術(shù)也存在一些不足,實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性差。首先是顯性遺傳,不能識(shí)別雜合子位點(diǎn)，這使得遺傳分析相對(duì)復(fù)雜，在基因定位、作連鎖遺傳圖時(shí),會(huì)因顯性遮蓋作用而使計(jì)算位點(diǎn)間遺傳距離的準(zhǔn)確性下降;其次,RＡPＤ對(duì)反應(yīng)條件相當(dāng)敏感,無(wú)論是模板質(zhì)量和濃度,單一短引物序列,非特異性擴(kuò)增，基因組ＤNA的復(fù)雜性,技術(shù)設(shè)備等都是導(dǎo)致ＲＡPＤ技術(shù)重復(fù)性差的原因。１。３序列特異性擴(kuò)增區(qū)域(Ｓeｑuｅncecharａctｅｒizedａmpｌiｆiedregｉｏｎs,ＳCAR）Ｐaｒan和Mｉcｒｈlｍore（1９９３）首次提出ＳCAＲ標(biāo)記，該標(biāo)記是在RAPD標(biāo)記的基礎(chǔ)上發(fā)展的[２５］。基本步驟：先做ＲＡPD分析,然后將RAPD標(biāo)記片段從凝膠上回收并進(jìn)行克降和測(cè)序，根據(jù)RＡPＤ片段的兩末端序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物(一般1８—24ｂps左右)，對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,篩選鑒定對(duì)應(yīng)RAPD片段的單一位點(diǎn)。該標(biāo)記由于所用引物較長(zhǎng)及引物序列和模板DNA完全互補(bǔ)，因此可在嚴(yán)格條件下擴(kuò)增，結(jié)果穩(wěn)定性好，可重復(fù)性強(qiáng)，比較屬內(nèi)種間差異能力更強(qiáng),在基因定位和做圖在的應(yīng)用前景廣泛.Zijlstra等利用ＳCAＲ標(biāo)記成功鑒定了南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲,而且結(jié)果顯示所獲得的標(biāo)記能特異性鑒定根結(jié)線蟲生活史各齡期［2６～27］。１．4擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Ampｌifｉedfrａgｍeｎtlengｔｈｐｏlymorｐhｉsm，AFLP)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AＦLＰ）是基于RＡＰD和RＦＬP相結(jié)合的一種DＮＡ指紋技術(shù).其原理是利用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA產(chǎn)生不同大小的DNA片段再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，使用雙鏈人工接頭與基因組DNA的酶切片段相連接作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板DＮＡ，用含有選擇性堿基的引物對(duì)模板DＮA基因選擇性擴(kuò)增,獲得的ＤNＡ擴(kuò)增片段通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測(cè).既具有RFLＰ標(biāo)記的專一性、可靠性,又具有RAPＤ標(biāo)記的隨機(jī)性、方便性。由于該標(biāo)記是通過選用不同的內(nèi)切酶達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的，因此又被稱作選擇性限制片段擴(kuò)增標(biāo)記(Seｌeｃtivereｓtrｉｃtｉｏnfrａgｍeｎtaｍplｉficａt(yī)ioｎ,SRFA)，AＦＬP是目前在種群遺傳多樣性研究中應(yīng)用較廣的分子標(biāo)記技術(shù)[28］。Fｏlkertｓma等（19９6)用ＡFLP方法對(duì)２種馬鈴薯胞囊線蟲的２4個(gè)群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析,可明顯將馬鈴薯金線蟲分為3個(gè)不同的致病型[29]。Sａmblat等對(duì)3種根結(jié)線蟲的15個(gè)群體的遺傳多樣性進(jìn)行了AＦLP研究，結(jié)果表明種間遺傳差異顯著,種內(nèi)遺傳變異不同,花生根結(jié)線蟲的遺傳多態(tài)性最豐富[３０]。Kapｌａn等（１99９）利用ＡFLP標(biāo)記能探測(cè)到甜菜胞囊線蟲(Ｈ。scｈachtiｉ）種內(nèi)群體基因的變異[３1]。Maｒｃｈe等(２００1）對(duì)來自美國(guó)和墨西哥的煙草胞囊線蟲進(jìn)行了AFLP分析，明確指出兩者屬于煙草胞囊線蟲的不同亞組［32］。ＡFLP技術(shù)與其它的ＤNA指紋技術(shù)相比具有效率高、重復(fù)性好、多態(tài)性強(qiáng)分辨率高以及不受基因組遺傳背景信息局限等優(yōu)點(diǎn)。其缺點(diǎn)主要是AFＬP是一項(xiàng)專利技術(shù)，受專利權(quán)保護(hù)，實(shí)驗(yàn)成分和造價(jià)費(fèi)用昂貴；對(duì)基因組的復(fù)雜性認(rèn)知程度有限,內(nèi)切酶的選擇具有盲目性;對(duì)DNA純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求較高，操作技術(shù)難度大等方面。但隨著ＡFLＰ操作步驟的簡(jiǎn)單化、規(guī)范化和自動(dòng)化,其分析效率會(huì)進(jìn)一步提高，應(yīng)用范圍會(huì)不斷擴(kuò)大.1．6簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Ｓｉmpｌｅseqｕencｅｒeｐｅat,ＳSR)SＳＲ也稱微衛(wèi)星（Mｉcｒosａｔeｌliｔe)，是一種由2-5個(gè)核苷酸為重復(fù)單位串聯(lián)組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的序列，其廣泛分布于整個(gè)真核生物基因組的不同座位上,具有重復(fù)性好、多態(tài)性高、實(shí)驗(yàn)程序簡(jiǎn)單和對(duì)模板DＮＡ的要求低（幾百個(gè)堿基對(duì)就可用作模板DＮA)等特點(diǎn)［33].ＳＳR標(biāo)記的基本原理：根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的特定短序列設(shè)計(jì)引物，通過ＰCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段。由于核心序列重復(fù)數(shù)目不同，因而擴(kuò)增出不同長(zhǎng)度的PＣR產(chǎn)物,這是檢測(cè)ＤNA多態(tài)性的一種有效方法。目前已利用微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建了人類、小鼠、大鼠、水稻、小麥、玉米等物種的染色體遺傳圖譜,這些微衛(wèi)星標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于基因定位及克隆、疾病診斷、親緣分析或品種鑒定、農(nóng)作物育種、進(jìn)化研究等領(lǐng)域［34］.Tｈierｙ和Mｕgｎiery（2０00）首次將微衛(wèi)星分離技術(shù)應(yīng)用到植物寄生線蟲上,對(duì)馬鈴薯白線蟲的基因庫(kù)進(jìn)行了分析,獲得含有效微衛(wèi)星重復(fù)子的克隆，并以此設(shè)計(jì)特異性引物,對(duì)不同的馬鈴薯白線蟲群體及球形胞囊線蟲屬的部分線蟲進(jìn)行了檢測(cè)［３5];200３年Ｈe等獲得了來自標(biāo)準(zhǔn)劍線蟲（Ｘｉphineｍａindex）7個(gè)不同的含微衛(wèi)星重復(fù)子的DNA分子標(biāo)記片段，除微衛(wèi)星標(biāo)記XIMSLI外，其它標(biāo)記均可用于標(biāo)準(zhǔn)劍線蟲的診斷和種內(nèi)群體遺傳多態(tài)性的分析[3６]。SＳＲ是目前較好的遺傳標(biāo)記之一，具有重復(fù)性好、多態(tài)性高、實(shí)驗(yàn)程序簡(jiǎn)單和對(duì)模板DNＡ的要求低等特點(diǎn)，但獲得SSR標(biāo)記一般需要建立、篩選基因組文庫(kù),克隆測(cè)序,引物設(shè)計(jì)等一系列實(shí)驗(yàn)，特別是依賴測(cè)序設(shè)計(jì)引物，成本較高。而且，SSR標(biāo)記中所用引物不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異較大。但隨著微衛(wèi)星研究的深入,新的序列大量涌入GｅneBaｎk中，SSR標(biāo)記必定會(huì)在ＤＮA多態(tài)性領(lǐng)域發(fā)揮更重要的作用。２問題與展望分子標(biāo)記技術(shù)作為一種新型的分子生物學(xué)技術(shù)，已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于植物寄生線蟲基因定位、疾病診斷、遺傳變異、品種鑒定以及親緣進(jìn)化關(guān)系等相關(guān)領(lǐng)域.分子標(biāo)記技術(shù)由于不受線蟲發(fā)育階段、環(huán)境條件以及蟲量的限制,只用單條線蟲就可以將其鑒定到種或種以下的水平，解決形態(tài)學(xué)上不能解決的分類鑒定中的難題。特別是以其快速、準(zhǔn)確、微量、靈敏度高、程序簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于植物檢疫檢測(cè)中，是目前線蟲學(xué)中發(fā)展較快的一種鑒定手段。然而ＤＮＡ分子標(biāo)記技術(shù)運(yùn)用于植物病原線蟲學(xué)中的研究?jī)H有10余年的時(shí)間，從實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)到數(shù)據(jù)處理分析都有著很多不完善的地方。如何把傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記研究方法與現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)有機(jī)的結(jié)合起來是一個(gè)關(guān)鍵的問題；如何從病原線蟲復(fù)雜的基因組中選擇有效的、具有豐富遺傳信息的并能夠真實(shí)反映遺傳關(guān)系的分子標(biāo)記,也是一個(gè)很大的難題；如何建立廣泛認(rèn)可的分子標(biāo)記研究技術(shù)是研究者們所面臨的難題。DNA分子標(biāo)記從它誕生之日起，就引起了生物科學(xué)家極大的興趣，在經(jīng)歷了短短幾十年的迅猛發(fā)展后，分子標(biāo)記技術(shù)日趨成熟。以分子雜交為基礎(chǔ)的標(biāo)記由于具有放射性而逐漸被操作性好、穩(wěn)定性強(qiáng)的以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記所取代。隨著分子生物學(xué)理論與技術(shù)的迅猛發(fā)展，必將不斷地開發(fā)出診斷速度更快、成本更低、信息量更大的分子標(biāo)記，而分子標(biāo)記技術(shù)與DNA提取程序化、電泳膠片分析自動(dòng)化、信息處理智能化的結(jié)合，必將加速其在病原線蟲遺傳圖譜的構(gòu)建、基因的定位、生物多樣性分析、物種親緣關(guān)系鑒定及與相關(guān)致病基因的診斷等各個(gè)領(lǐng)域的進(jìn)一步研究.?參考文獻(xiàn)1。周延清．DＮA分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用[M］。北京:化學(xué)工業(yè)出版社，２0０５，５６-５７。2.劉光興.遺傳標(biāo)記技術(shù)在海洋橈足類生物多樣性和系統(tǒng)發(fā)生研究中的應(yīng)用[J］.中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，37（1):3３-３７。３。王志林，趙樹進(jìn),吳新榮。分子標(biāo)記技術(shù)及其進(jìn)展[J]。生命的化學(xué),20０1,２1(１)：39—42．4.余道堅(jiān)，鄧中平,陳志磷等.昆蟲分子標(biāo)記基因和序列及應(yīng)用.植物檢疫,２00３，１7（3):１５6－1５9.5．吳姍,吳蓉，林曉佳等．分子生物學(xué)技術(shù)在松材線蟲研究中的應(yīng)用植物檢疫,２005，3１(5）：１５－19．6．王英超,邵秀玲,封立平等．大豆莖褐腐病的研究進(jìn)展及其檢疫技術(shù)．植物檢疫,２007,２1（4）:２22－２2９.７。趙文軍，夏明星，陳紅運(yùn)等．番茄潰瘍病菌ＰCR快速檢測(cè)技術(shù).植物檢疫，2007，２1（2）：７５-７7．8.趙鴻，彭德良,朱建蘭。rDＮＡ—ITＳ2—ＰCR技術(shù)在植物寄生線蟲分子診斷中的應(yīng)用［J]．植物檢疫,２０04,18（2):１００-1０5．9．朱玉賢，李毅?，F(xiàn)代分子生物學(xué)［M］.2版。北京：高等教育出版社,200210。Bolla，R.Ｉ.aｎdWｅavｅｒ，C．ＧｅnomicｄiｆｆｅreｎcｅsamongpaｔｈｏｔypｅｓoｆBuｒsaｐｈelｅncｈusxyｌｏphｉlus.JournalofNemａｔology,１988,2０：3０９—316.１1。Websｔeｒ,J.M.,Anｄｅｒsoｎ,Ｒ。V。，Ｂａilｌie，D．L。,etal。DNAｐrobeｓｆordiffｅｒｅｎｔｉａt(yī)ingisｏlatｅsofthepｉnｅｗoodnｅmaｔoｄespeｃiｅscｏmｐleｘＲevueｄeNeｍatologie．1９90．13:２5５—２63。１２。Ｂendｅｚu，I。Ｆ。，Evans，K。，Burｒoｗｓ，Ｐ.Ｒ。，etａｌ．Inteｒａndｉntra-ｓｐｅｃiｆiｃgｅnｏmiｃvariａbiｌｉｔyｏftheｐotaｔｏcyｓtnemａt(yī)odｅsGloｂｏｄｅrapallｉdａaｎｄG．ｒosｔｏchiensisｆromＥuroｐｅanｄSｏutｈAmｅricausｉｎgＲAPD－ＰＣR．Neｍatoｌoｇｉｃa，1９９8，44：49-６1．1３.Pａran，I。andMｉｃrhlmｏrｅ，R．W．DeveｌopmentofｒeｌiａｂlePCR-baｓedｍarkｅrｓｌｉｎkeｄtoｄowｎyｍiｌdewｒeｓistaｎｃｅgenesinlettucｅ.Ｔhｅor．Apｐl．Geｎｅt,1993，8５：9８5—9９３。１4．Williａｍs，J.Ｇ.Ｋ．,Kｕｂelika,R。，anｄLivak,K．J。DNＡpolymorphismsamｐlifiｅdbｙarbiｔraｒyｐrｉｍersaｒｅｕseｆulaｓgeneticｍarkeｒs．NｕｃleicAcidsResｅarch,１990，18:６5３1-6535．１５．Irdani,T．，Mａrinari，Ａ.，Bogani，P.,eｔａｌ。MolecｕlardｉvｅrｓｉtyａmonｇｐinｅwｏodＢursａphelｅnｃhｕspoｐulationsｄｅtｅctｅdbyRAPＤanａlysis．Rｅｄia,19９５,78：14９—161．16.Brａａsｃh,H。anｄBurgeｒｍeiｓter，W。DiｆfeｒentｉationoｆthreeＢuｒｓａpheｌeｎｃhusｓpecｉesｂｙmｅａnsofＲＡＰＤ-ＰＣＲ.NａｃhicｈtenblaｔtdesDeutschｅnＰflanｚeｎschutzdienstes，19９5,47（1２):3１0—3１4.17。鄭經(jīng)武,許建平，吳玉良等．松材線蟲和擬松材線蟲種間及種下群體的RAＰＤ指紋分析。浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998,24:597-６01.１8．汪來發(fā),王揚(yáng)，楊寶君等。利用ＲAPＤ研究松材線蟲和擬松材線蟲親緣關(guān)系．植物病理學(xué)報(bào)，200１，31：２25-22９。１9．張路平,孔繁瑤，楊寶君。松材線蟲和擬松材線蟲不同株系線粒體ＤNARＡPＤ分析.林業(yè)科學(xué)研究,2002，15:7-１2。20。Ａｍiｒｉ，S。，Subbｏtiｎ，Ｓ．，ａndＭoenｓ,M。ComｐaratｉvemorｐhomeｔｒicsandRＡＰDstudiesoｆHｅteroｄeｒaschachtｉianｄH。bｅtａｅpoｐｕlatioｎｓ．RussiａnJouｒnａｌofＮemａｔｏlｏgy，2０0３，１1:９1－９9.21.Ｃａrneiro，R.M.D.G.,Tigａｎｏ,M。S。，Randｉg,O.，Ａｌｍｅｉｄａ,M.Ｒ。A。ａnｄSarａh,J．L．IdentiｆicaｔioｎandｇｅｎｅticdｉverｓityｏfMeloｉｄｏｇｙnｅｓｐp.（Tyleｎchida：Melｏiｄynidae）onｃoffeeｆromBraｚil,CｅntｒalＡmｅｒｉｃaandHaｗaii。Nｅmａt(yī)olｏｇｙ，200４,6：287－29８.22。Lａx，Ｐ。，Ｄｕeｎas，J．Ｃ.R。，Gａrdenal.C．Ｎ.andＤｏucet，M.Ｅ.ＧeｎｅticvaｒiabiｌｉｔｙｅｓtiｍａｔedｗｉthRＡＰＤ—PCRmaｒkerｓinｔwｏpopulationsofHeｔｅｒｏdｅｒaｇlycｉnesIchinｏｈe，1９５２（Nematoｄａ:Ｈeteroderｉｄae)froｍArgentina.Nematolｏｇｙ,2０04，6：1３－２1。2３.Esquiｂｅt，Ｍ。,Gｒenｉeｒ，Ｅ。，Pｌantａrｄ，O.,etal。DＮApｏlｙｍｏｒｐhiｓmｉntｈeｓtemneｍatodｅDｉｔｙlｅｎchusｄipsａｃideｖelopmentofdiａgｎｏｓtiｃｍarkeｒsfoｒnormalａnｄgｉaｎtraces．Genome，２０03,46：1077-108３．24.Tｈiery，M,Ｆouvilｌe,DanｄＭｕｇniｅrｙ，D．Ｉntrａ－aｎdｉnterｓpｅｃificｖaｒiabｉliｔyinGlobｏdera,parasｉtesｏｆSolａｎaｃeouｓplants,revealedbyｒandomamplifieｄpoｌｙmorphicＤNA（RAPＤ)anｄcｏｒreｌatｉｏnｗitｈbｉoloｇicalｆeatｕｒeｓ.Fundａmeｎｔalaｎdａppｌiedneｍａt(yī)oloｇy，1997,20:49５－5０4.25.黎裕,賈繼增，王天宇.分子標(biāo)記的種類及其發(fā)展［Ｊ].生物技術(shù)通報(bào)，19９9，15（4）：19-２２．26。Zijlstｒa，Ｃ.,Dｏｎｋeｒｓ-Ｖeｎｎe,Ｄ.T．Ｈ。M。anｄFａｒｇette，M.ＩdeｎtiｆｉcatiｏnofMelｏidｏｇyneｉnｃogniｔａ，Ｍ。jａvａnicaandM.aｒenａｒiausingseｑuenceｃhaｒacｔeｒｉzedamｐlifｉedrｅgiｏn（ＳCＡＲ）bａsedPCRassaｙs。Nematｏlogy,２0０0，2:8４７—８５3．27.Ｚijlｓｔra，C．IｄentｉｆicationｏfＭeloｉdogyｎeｃhｉtwｏodi,Ｍ．fａｌｌaxaｎdＭ．ｈaplａbasｅdonＳCＡR-PCＲ：aｐowｅrｆulwａyｏfenａｂliｎgreliａbｌｅidenｔificａt(yī)ｉonｏｆｐoｐuｌａt(yī)ionsorindividｕalsｔhatshａrｅcommｏｎtrａitｓ．Ｅｕrｏpｅanjouｒnａｌofplａｎtpatholｏgy,2０0０,1０6：２83－2９０。２8.Vｏｓ，P．，Ｈogers，R.aｎｄBlｅｅｋer，Ｍ.AFLP：anewtｅcｈｎｉｑｕefoｒDNＡｆinｇeｒprintiｎg.NｕcleiｃAcｉｄｓRｅsｅａrｃｈ,1９95，23:４40７—４41４.29．Folkｅrｔsｍa,R。T。，RouppｅｖaｎdeｒVooｒt，J.N。Ａ.M．a(chǎn)ｎｄdeGrｏｏt，K.Ｅ。GeｎeｐoolｓimｉlａｒｉtｉeｓoｆpｏｔatoｃyｓtnematｏdepopulatｉonｓasｓeｓｓeｄbyAＦLＰａnalyｓis．Ｍｏlｅcuｌａrplanｔ－microbｅｉnteracｔioｎs，1996,9:47