第四章 基因工程的主要技術及其原理

基因工程的支撐技術

第四章基因工程的主要技術及其原理核酸凝膠電泳技術核酸分子雜交技術細菌轉化轉染技術DNA序列分析技術寡核苷酸合成技術基因定點突變技術聚合酶鏈反應（PCR）技術原理

瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應。不同DNA的分子量大小及構型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶瓊脂糖凝膠電泳凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，是由D—半乳糖和3、6—脫水—L—半乳糖結合的鏈狀多糖

豬基因組DNA及PCR產(chǎn)物電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測儀等。瓊脂糖，1XTAE電泳緩沖液，溴化乙錠（EB），6X載樣緩沖液：Ⅰ0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液;Ⅱ0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液實驗材料、器具及藥品相關知識：①影響瓊脂糖凝膠DNA遷移速率的因素、遷移速率由DNA的分子大小、瓊脂糖濃度、DNA的構象、所加電壓、電場方向、堿基組成與溫度、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的組成等許多參數(shù)確定。

表瓊脂糖濃度與DNA分離范圍

實驗步驟⑴1g瓊脂糖加入100ml1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到60℃，加入100μl的0.5mg/mlEB，并搖勻。）⑵用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固⑶充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。(4)用移液器吸取總DNA或質粒樣品4μl于點樣板上，再加入上樣緩沖液loadingbuffer，混勻后，小心加入點樣孔。⑸打開電源開關，調節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動，電泳約30min-60min。⑹將凝膠放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。⑺將染色后的凝膠置于紫外透射檢測儀上，蓋上防護觀察罩，打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的DNA條帶。實驗步驟結果與分析

圖2基因組DNA1%瓊脂凝膠電泳圖結果與分析

圖2

PCR產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳圖

(1、2、3、4為PCR產(chǎn)物，M為DL2000Marker)瓊脂糖凝膠電泳裝置實驗步驟制膠90℃以上熔化，凝膠溫度35-43℃EB1231、孔深2、預留尺寸3、梳子寬度1+2=膠的厚度3-+加緩沖液拔梳子最好在電泳槽中-+點樣-+電泳紫外﹢﹣﹣﹢電泳結果分析DNA空間結構電壓

EB脈沖電場（PFGE）解決大分子DNA電泳問題Blotting定義：印跡法（blotting）是指將樣品轉移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA或者DNA-DNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質分子的印跡分析稱為Eastern印跡法(1)Southern印跡雜交法

限制性內切酶酶切

檢測雜交信號

提取DNA

Southern法可用于檢測特異的DNA序列片段,進行基因定位、分子量測定等。SouthernBlotPartI:GelelectrophoresisfollowedbytransfertoamembraneDNACleavedwitharestrictionenzymeSmearofrestrictionfragments80度烘烤1-2hSouthernBlotPartII:HgybridizationofDNAonmembranetospecificprobeDNAstainedwithethidiumbromideautoradiographofhybridizedmembraneSouthernBlotNorthernBlotprobedwithb-globinUndifferentiatedcells+differentiationfactorNote:MakenorthernjustlikeaSouthern,exceptrunoutRNAsamplesratherthanDNAMeasuresthesteady-statelevelofmRNAtranscriptfromagivengeneSmearofRNAtranscripts

核酸雜交技術是目前研究核酸結構、功能常用手段之一，不僅可用來檢驗核酸的缺失、插入，還可用來考察不同生物種類在核酸分子中的共同序列和不同序列以確定它們在進化中的關系，其主要應用如下圖所示：核酸雜交及其應用示意圖

Ⅰ.變性、復性和雜交。粗細線分別代表不同DNA。A是雜化雙鏈Ⅱ.突變體的鑒別。B代表天然DNA；C是B的缺失突變體；虛線框內是已缺失的部分；D是顯示從天然DNA鏈鼓出小泡

Ⅲ.粗線代表探針，粗線上的X表示放射性標記

在核酸雜交的基礎上發(fā)展起來的一種用于研究和診斷的非常有用的技術稱探針技術(Probe)。

探針技術在遺傳性疾病診斷上已開始應用。例如診斷地中海貧血或血紅蛋白病，可以由已確診的病人白細胞中提取DNA，這就是診斷探針。用診斷探針檢查，不但可以對有癥狀患者進行確診，還可以發(fā)現(xiàn)一些沒有癥狀的隱性遺傳性疾病。如從胎兒的羊水可以提取到少量DNA后，再用探針技術對此進行產(chǎn)前診斷各種遺傳性疾病已在臨床上開展。

雜交和探針技術是許多分子生物學技術的基礎，在生物學和醫(yī)學的研究中，以及臨床診斷中得到了日益廣泛的應用。Westernblot實驗技術

MakingaprobeUsetheknownaminoacidsequenceofaproteinSynthesiseashortDNAsequenceinvitroAA:phemettrpglucysasnCodons:UUUC

AUGUGGGAAGUGUCAAUCProbe:AAAGTACACCCTTCACAGTTAG

-P32Ashortsequenceofaproteinisusedtodesignasetofoligonucleotidesforuseasaprobetorecoverthegenethatencodedtheprotein.OneoftheprobesequencewillbeaperfectmatchforthegeneWesternBlot基本原理

在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。WesternBlot一般流程蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色通過有機溶劑或水溶法制備總蛋白水溶液提取法針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑。

細胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40，0.05%PMSF，2μg/mLAprotinin,0.5μg/mLLeupeptin，pH8.0

有機溶劑提取法對于分子中非極性側鏈較多的蛋白質可用有機溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通過層析或電洗脫法制備目的蛋白蛋白樣品的制備蛋白樣品的定量Bradford法

考馬斯亮藍G-250有紅、藍兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結合后形成藍色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比。(上樣量)試劑：考馬斯亮藍工作液，0.1N鹽酸，雙蒸水，蛋白標準液（將10mg/ml蛋白溶液稀釋至4.0mg/ml,3.5mg/ml,3.0mg/ml,2.5mg/ml,2.0mg/ml,1.5mg/ml,1.0mg/ml,0.5mg/ml。）管號012345678ddH2O807070707070707070蛋白標準液01010101010101010樣品101010101010101010HCL101010101010101010SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：SDS是一種離子性的界面活性劑,它有強離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.當SDS與蛋白質混合時,它會以其碳鏈與蛋白質之疏水性胺基酸結合將蛋白質包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質和SDS的平均結合量是1:1.4(以重量為單位),而蛋白質結合固定比例之SDS後,由於SDS帶強負價,使蛋白質原先的帶電價微不足道,且每單位重量之蛋白質帶電價一致(chargedensity),所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項因素丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺

SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過硫酸銨(時間)Tris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（％）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212轉膜膜的選擇尼龍膜硝酸纖維素膜封閉非特異性抗體結合麻煩簡單快速封閉非特異性抗體結合價格昂貴價格便宜特殊要求下的選擇需要更高的蛋白結合率（尼龍膜：480μg/cm2

；硝酸纖維素膜：80μg/cm2

）目的蛋白與硝酸纖維膜的結合能力弱需要更大的機械強度轉膜半干法將凝膠和固相基質象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間，電轉10－30min。濕法將凝膠和固相基質夾在濾紙中間，浸泡在轉移裝置的緩沖液中，電轉45min或過夜。

轉膜后檢測麗春紅S染色蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。印度墨汁染色只用于放射性標記抗體或放射性標記A蛋白探針的Western印跡過程。封閉脫脂奶粉（5％）BSAWesternBlot膜封閉液（生物試劑公司提供）一抗、二抗孵育把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液與濾膜溫育。37℃一小時，4℃過夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動，37℃一小時，4℃過夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。二抗與底物反應顯色辣根過氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學發(fā)光顯色法(HRP)WesternBlot常見問題分析SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入APS和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻導致膠聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對齊條帶比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡量混合均勻，動作輕緩拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導致寬窄不一，純化樣品，調整鹽濃度膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應趕走氣泡。同時注意電泳槽裝置是否合適轉膜及抗體檢測凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個或多個白點？轉膜緩沖液過熱？可將凝膠在轉膜之前放到轉膜緩沖液中浸泡5-10min電轉儀長期使用導致海綿變薄，“三明治”結構不緊湊導致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的草紙確保膜和膠塊之間沒有氣泡緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉膜過程注意降溫背景太高膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應抗體濃度過高

原原因對策轉膜前用100%甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉膜緩沖液檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度Westernblotissimilarinconcepttonorthern,exceptusepolyacrylamideandrunoutproteinsSouthern,Northern,andWesternanalyses免疫化學檢測法Usingantibodiestodetectaclone重組體的轉化利用物理方法導入、轉化

1.質粒的Ca2+誘導轉化(E.coli)2.質粒的原生質體轉化

3.質粒的高壓電穿孔法轉化

4.顯微注射法轉化利用生物方法導入、轉染1.細胞噬菌體DNA的轉染2.動物病毒DNA的轉染3.植物病毒DNA的轉染大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備在不含抗生素的LB平板上涂布大腸桿菌DH5α，于37℃培養(yǎng)過夜(16-20h)；挑一個單菌落接種于25mL無菌的LB培養(yǎng)液中，37℃中速震蕩培養(yǎng)3h；將上述菌液在冰浴5分鐘,然后在4℃,4000rpm離心10分鐘;將細菌沉淀用5mL預冷的CaCl2（0.1M）重懸，冰浴一會后于4℃4000rpm離心10分鐘；將細菌沉淀用1mL預冷的CaCl2（0.1M）重懸，取200uL用于細菌轉化,其余菌液加入20%的無菌甘油,搖勻后于-20℃保存?zhèn)溆?感受態(tài)細胞的轉化

（1）取2μL連接產(chǎn)物，加入80μL感受態(tài)細胞，混勻，冰上放置30min。（2）將反應管快速轉移42℃水浴中，熱擊90s。（3）將反應管快速轉移至冰上2min（4）加入500-800μLLB液體培養(yǎng)基。（5）37℃，150rpm復蘇1.5h。（6）取100μL菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上（含100μg/mL的Amp）（7）37℃下培養(yǎng)16-24h。TransformingE.coliwithrecombinantDNAGrowthofBacteriaPCR技術及其應用

目錄PCR的概念PCR技術的創(chuàng)建PCR的原理PCR的反應體系和方法PCR的類型和應用

多聚酶鏈式反應（PCR：PolymeraseChainReaction)Polymerase:

DNA聚合酶

基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴增PCR技術的創(chuàng)建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術,使Khorana的設想得到實現(xiàn)。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術

1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。PCR技術簡史

PCR的最早設想：本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術，Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。PCR技術PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長PCR技術PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技術PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技術PCR技術簡史PCR的改進與完善：

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的一個片段，其缺點是：①此酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。PCR技術②其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，此種酶催化的PCR技術雖較傳統(tǒng)的基因擴增具備許多突出的優(yōu)點，但由于酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期，給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得PCR技術在一段時間內沒能引生物醫(yī)學界的足夠重視。PCR技術PCR技術簡史94℃55℃37℃PCR技術簡史1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。PCR技術TaqDNA聚合酶的特點：①耐高溫，在70℃下反應2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度(2.0Kb)。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。PCR技術PCR技術簡史Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)405060708090100100806040201988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術72℃94℃55℃PCR循環(huán)PCR技術的原理1PCR技術的基本原理

無細胞分子克隆法：在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴增了特異區(qū)段的DNA帶。

加熱變性復性復溫DNA的變性和復性加熱或強酸、堿性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這稱為DNA的變性。解除變性的條件后,變性的單鏈可以重新結合起來,形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復,這稱DNA復性,也叫退火。

PCR反應條件PCR過程PCR反應條件PCR過程PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR技術PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR技術復習PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR技術PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR技術PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結束95℃第2輪開始PCR技術PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR技術PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結束PCR技術PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點重復30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增PCR技術2PCR技術的特點1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍2）特異性引物引物

引物的序列及其與模板結合的特異性是決定PCR反應結果的關鍵。引物設計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。引物設計：（1)序列應位于高度保守區(qū),與非擴增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機分布,G+C占50-60%。（4）引物內部避免形成二級結構。（5）兩引物間避免有互補序列。（6）引物3’端為關鍵堿基；5’端無嚴格限制。3）操作簡便易行PCR擴增法,只需要數(shù)小時,就可以用電泳法檢出1μg基因組DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。通常的DNA擴增法是分子克隆法,首先要構建含有目的的基因的載體,然后將它導入細胞后進行擴增,還要用同位索探針進行篩選;這種方法,要經(jīng)過DNA內切、連接、轉化和培養(yǎng)等相關的過程,操作復雜,一般需要數(shù)周時間。目的基因載體復制子宿主細胞擴增擴增提取DNA分子4）用途廣泛生命學科醫(yī)學工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學考古學PCR的反應體系和方法PCR管加熱使模板變性,退火使引物與模板DNA互補,延伸需將反應溫度升至中溫(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP為原料,以引物為復制的起點,合成新鏈。如此重復改變反應溫度,即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴增產(chǎn)物進行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。

1反應體系標準的PCR反應體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uBuffer（Mg2+）

1.5mmol/LPCR技術PCR技術的基本過程(1)模板DNAdNTP引物Buffer預變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’2基本過程PCR技術的基本過程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循環(huán)儀94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循環(huán)25～35次瓊脂糖凝膠電泳PCR技術的基本過程(3)1）PCR反應成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。3PCR反應條件（2）引物濃度

0.1-0.5mol/L

濃度過高易導致模板與引物錯配,反應特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l

酶量增加使反應特異性下降;酶量過少影響反應產(chǎn)量。（4）dNTPdNTP濃度取決于擴增片段的長度四種dNTP濃度應相等濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應產(chǎn)量

dNTP可與Mg2+結合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應特異性。Mg2+可與負離子結合,所以反應體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應中游離的Mg2+濃度。2）循環(huán)參數(shù)變性

使雙鏈DNA解鏈為單鏈

94oC20-30秒(2)退火

溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結合;降低溫度可增加反應的靈敏性。（3）延伸

70-75℃,一般為72℃

延伸時間由擴增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴增效率降低錯誤摻入率增加經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內）94℃30