第3、4、5次課 生化 天然產(chǎn)物化學(xué)(實驗技術(shù))

提取基礎(chǔ)分離白樺酸酯合成（化學(xué)、生物轉(zhuǎn)化）第三講天然藥物活性成分的提取與分離

重要性：－－天然藥物的開發(fā)（WTO，知識產(chǎn)權(quán)）一、提取1文獻(xiàn)2系統(tǒng)預(yù)試→化學(xué)成分種類3提取溶劑（根據(jù)目的成分選擇）水（鞣質(zhì)、糖類、蛋白質(zhì)）冷水、熱水HCl、NaOH→成鹽溶出醇（乙醇、甲醇）95%→alkaloids60-70%→皂苷、黃酮苷40-50%→強(qiáng)心苷丙酮、乙酸乙酯、氯仿等（苷元）4提取方法（根據(jù)提取目的、要求和條件選擇）冷浸法（3-4次）滲漉法：熱不穩(wěn)定物、可按極性梯度提取煎煮法（3-4次）回流提?。?-4次）連續(xù)回流提取法超臨界流體萃取超聲波提取微波提取二、分離

1分類粗分（部位分離）細(xì)分（部位分組）單離（單體成分分離）粗分細(xì)分2方法色譜法（平面色譜、柱色譜、逆流色譜）結(jié)晶平面色譜

薄層色譜TLC(ThinLayerChromatograph)

功能：定性分析（預(yù)試、指導(dǎo)分離)

對照—標(biāo)準(zhǔn)品種類：硅膠G,GF254、RP-18

、聚酰胺顯色：通用—碘、H2SO4/EtOH

專屬—alkaloids,flavonoids"硅膠H"-不含粘合劑；"硅膠G"-含煅石膏粘合劑；"硅膠HF254"-含熒光物質(zhì)，可用于波長為254nm紫外光下觀察熒光；"硅膠GF254"-既含煅石膏又含熒光劑.

實例：紫杉醇和三尖杉寧堿分離中的跟蹤檢測展開劑：二氯甲烷－正己烷－甲醇－三乙胺（3.5:4.5:0.5:1）注意事項：多元展開劑不能反復(fù)使用，須即配即用；嚴(yán)格控制組分比例；預(yù)飽和10min，減少邊緣效應(yīng)制備薄層色譜PTLC（PreparativeTLC）

功能：制備（達(dá)g級）

1、吸附劑（adsorbents）材料：Silicagel

尺寸：20*20,20*40cm

厚度：0.5-2mm

2、樣品帶手工、自動點樣器樣品帶寬的解決方法：用極性流動相展開約2cm，使帶變窄用帶濃縮帶的板子3、流動相選擇三角形法則4、樣品的收集洗脫顯色：定位轉(zhuǎn)移洗脫5、PTLC制備樣品時引入的雜質(zhì)粘合劑雜質(zhì)指示劑Other(分解物)(Al2O3作吸附劑)

解決辦法：SephedexLH-20

6、TLC技術(shù)的發(fā)展HPTLC巨形板TLC

不銹鋼板(60*60cm)；厚度：5mm上樣量＞10g帶濃縮帶TLC二維TLC多次展開（同方向）雙向展開加壓薄層色譜OPLC（OverpressureLayerChromatography）又稱OverpressureTLC(OPTLC)

1、簡介

1979年，HPTLC吸收HPLC的某些特點：平面、細(xì)顆粒、蒸氣相、恒流速2、特點與傳統(tǒng)PTLC比較效率50mg~0.5g；1h3、制備型OPLC聯(lián)機(jī)檢測、分段收集4、應(yīng)用氨基酸，多肽，胡蘿卜素，生物堿等

離心薄層層析（CTLC）

centrifugalThinLayerChromatogram1、概述

CTLC是在TLC和柱色譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來，利用旋轉(zhuǎn)離心力，連續(xù)洗脫。2、儀器傾斜盤、流動相中央進(jìn)入梯度、UV檢測、N2保護(hù)固定相活化、反復(fù)使用3、特點（1）分離快速（<30min）（2）流動相少（3）進(jìn)樣量大（4）可梯度洗脫（5）直接檢測，接收靈活（6）色譜板可反復(fù)使用（7）操作簡單，占地小，移動方便柱色譜

ColumnChromatogrphy

常壓柱色譜

(0.1~50g)

（OrdinaryColumnChromatogr.）吸附柱色譜分配柱色譜植物有效

柱色譜離子交換柱色譜成分分離凝膠過濾柱色譜主要手段聚酰胺柱色譜大孔吸附樹脂一、吸附性色譜Al2O3orSilicagel

生物堿水溶性Al2O3甾體脂溶性Silicagel揮發(fā)油脂溶性

1裝柱Al2O3：吸附劑:樣品(20~50:1)→(20~100:1)Silica：吸附劑:樣品(30~100:1)→(300~400:1)1)干法與TLC吻合度較好，溶劑消耗少2)濕法緊密，前沿整齊2上樣1)濕法：溶劑溶解上樣（少量），低極性2)干法：低極性溶劑溶解性差3洗脫常壓、低壓、梯度洗脫4收集與檢查等份TLC、UV二、聚酰胺（Polyamide）1原理（1）氫鍵吸附原理：基于酰胺鍵酚類、酸類、醌類、硝基化合物成氫鍵能力與溶劑有關(guān)水<甲醇<乙醇<丙酮<稀氨液<稀NaOH氫鍵吸附規(guī)律：基團(tuán)多少；基團(tuán)位置；芳香核；共軛雙鍵；分子內(nèi)氫鍵（2）極性吸附原理：基于非極性脂肪鏈萜類、甾體、生物堿黃酮苷非水（正相）；含水（反相）2聚酰胺粉的制備國產(chǎn)（15~30目）、層析用（80~100目）粗粉蒸餾水浸泡過夜，磨細(xì)，混懸液直接使用抽濾后，60~80度烘干2~3小時備用。3操作裝柱：細(xì)粉水浸泡裝柱，自然沉降上樣：20~30%水溶液上樣，上樣量40-60:1

洗脫：水、含水醇、95%醇、3%NaOH、5%NaOH4再生：5%NaOH

三、分配柱色譜

1原理利用混合物在兩相互不混溶中分配系數(shù)不同，而達(dá)到分離的一種柱層析方法。分配系數(shù)差異愈大，分離效果愈好。2支持劑硅膠、硅藻土、纖維粉3溶劑系統(tǒng)的選擇PC、TLC4操作（1）裝柱（2）上樣（3）洗脫四、凝膠柱色譜（SephadexLH-20）

1葡聚糖凝膠簡介由葡聚糖凝膠SephadexG-25交聯(lián)親脂性羥丙基而制備，是同時具備吸附色譜、分配色譜和分子篩功能的獨特色譜介質(zhì)。溶劑系統(tǒng)沒有限制，包括水相緩沖液、丙酮、乙酸乙脂、氯仿、二氯甲烷、四氫呋喃、甲苯和各種混合溶劑。大量文獻(xiàn)證明它非常適合于天然產(chǎn)物純化，特別是中草藥有效成分如苷類、生物堿、黃酮、蒽醌、內(nèi)酯、帖類、甾類、多酚的分離。德國科學(xué)家HansHenke著有SephadexLH-20凝膠色譜分離專著。2原理分子篩：分子的大小和形狀吸附色譜：被分離化合物與凝膠間的氫鍵分配色譜：被分離化合物在流動相（溶劑）和固定相（凝膠）之間的分配3操作（1）裝柱洗脫劑溶脹后懸浮液攪拌裝柱。（2）上樣（3）洗脫水溶性好：水或電解質(zhì)溶液水溶性差：醇水或丙酮水極性較小：丙酮、氯仿（4）濃縮視情況而定（5）再生洗脫劑平衡有污染：0.2NNaOH→0.5NHCl浸泡水洗凈→平衡保存：50%丙酮水溶液4應(yīng)用實例川芎里的腺嘌呤貝母里的腺苷浙貝寧、茄啶日本附子里的烏頭堿銀杏黃酮苷夏枯草中的夏枯草黃酮苷、皂苷升麻中的酰胺苷水蔓菁中的水蔓菁萜苷鹿銜草中的鹿蹄草苷淫羊霍中的淫羊霍苷多種中草藥中的蘆丁蕓香苷紅花中的槲皮素、蘆丁、山柰酚、紅色素等多種黃酮麥冬中的麥冬黃酮鹿蹄草中的兒茶素紫草中的萘醌、多酚五、離子交換柱色譜1原理利用大分子樹脂網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)存在的交換基團(tuán)而進(jìn)行的交換性柱色譜方法。2影響離子交換的因素

PH值欲交換化合物的性質(zhì)欲交換化合物的濃度溫度交換溶劑交換流速樹脂用量3樹脂的選擇4操作（1）樹脂預(yù)處理（2）裝柱（3）上樣（4）交換（5）洗脫（6）樹脂再生六、大孔吸附樹脂色譜1簡介

大孔樹脂吸附技術(shù)是上世紀(jì)七十年代發(fā)展起來的一種新工藝，是由苯乙烯、二乙烯或a-甲基丙烯酸酯等聚合而成的高分子網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu)。

大孔樹脂吸附色譜操作的基本程序大多是：提取液－通過大孔樹脂－吸附上有效成分的樹脂－洗脫－洗脫液回收－洗脫液干燥－半成品。藥液通過大孔樹脂吸附，其中的有效成分吸附在樹脂上，再經(jīng)洗脫回收，可除掉藥液中雜質(zhì)，是一種純化精制藥的有效方法。該技術(shù)目前已較廣應(yīng)用于新藥開發(fā)和生產(chǎn)中,主要用在分離和提純過程中。2原理：非極性吸附樹脂在吸附藥液中成分時，主要是依靠物理結(jié)構(gòu)（如比表面、孔徑等）起作用，不同的樹脂有不同的針對性。4影響分離的因素分子極性大小分子體積PH值樹脂柱的清洗洗脫液的選擇3操作（1）樹脂預(yù)處理（2）裝柱（3）上樣（4）洗脫（5）樹脂再生5優(yōu)點可有效地去除水煎液中大量的糖類、無機(jī)鹽、黏液質(zhì)等吸潮成分；有利于多種中藥劑型的生產(chǎn)，增強(qiáng)產(chǎn)品的穩(wěn)定性；大孔樹脂吸附技術(shù)還能縮短生產(chǎn)周期，所需設(shè)備簡單。免去了靜置沉淀、濃縮等耗時多的工序。6實際應(yīng)用

適合中等程度的水溶性化合物：天然色素，從發(fā)酵液中得到抗生素（青霉素、先鋒霉素、螺旋霉素）、蛋白質(zhì)（胰島素、肽系抗生素）、功能性食品添加劑（維生素）等。聚苯乙烯合成吸附樹脂吸附含有π電子的化合物，如含有苯環(huán)和共軛雙鍵的化合物；甲基丙烯酸甲酯類吸附劑吸附含羧基、酯基、氨基、酰胺基等與H可結(jié)合的官能團(tuán)的化合物。

特殊柱色譜（SpecialColumnChromatogr.）

干柱柱色譜減壓柱色譜植物有效成分

特殊柱層析短柱柱色譜分離新方法閃式柱色譜棒色譜

一、干柱柱色譜1簡介2特點（1）優(yōu)點分離效果比濕法裝柱高；可用薄層最佳分離條件直接套用；對有熒光或顏色的物質(zhì)，可在紫外燈下將已分離的各層帶分別切開，避免常規(guī)液相層析中因流出液收集不當(dāng)而造成的層帶交叉；適用于制備性分離；設(shè)備簡單，消耗溶劑少，工時省，（2）缺點樣品容量比濕法裝柱小，因此，消耗填充劑量大。（1）填充劑種類氧化鋁活性III~V吸附色譜硅膠活性II~III