香蕉枯萎病菌fusariumoxisporum的pcr-pcr檢測

香蕉枯萎病菌fusariumoxisporum的pcr-pcr檢測

由于仙童醇苯基乙烯的特殊化型（fusariumoxyspormf.c.c）引起的枯萎，是制約香蕉生產(chǎn)的毀滅性疾病。這是真菌性土壤傳遞的疾病。這種疾病從根本原因而受到影響，導致導管棕褐色和系統(tǒng)感染，整個植物死亡?，F(xiàn)在，中國對小品種1號和4號造成的破壞最為嚴重。通常由感病植株的癥狀變化來鑒定此病,但是產(chǎn)生典型癥狀的植株往往已到發(fā)病后期,而且可能已經(jīng)威脅到其它的植株,因此對該病的早期檢測診斷就顯得尤為重要。利用核糖體rDNA序列在物種進化中的保守性和易變性,及其在系統(tǒng)發(fā)育中具有種級以上階元標記的特性,設計引物,用于植物病害的早期檢測,已經(jīng)在棉花、番茄、西瓜等作物的病害檢測中得到了應用。在香蕉枯萎病的研究中漆艷香、謝藝賢及BentleyS等,利用RAPD-PCR方法對香蕉枯萎病菌2個生理小種間的親緣關系進行了研究,劉景梅等建立了廣東香蕉枯萎病菌RAPD分析技術,華南農(nóng)業(yè)大學的周鴻飛等也做過相關的檢測研究,但至今尚無詳細的文獻報道。本試驗通過對致病性鐮刀菌ITS序列的克隆分析,設計了兩對引物,對香蕉鐮刀菌枯萎病有較高的靈敏性和特異性。對香蕉枯萎病的快速檢測提供了良好的技術方法,在國內(nèi)對于香蕉枯萎病菌的分子檢測及其感病植株的早期檢測的報道尚屬首次。1材料和方法1.1試驗材料供試尖飽鐮刀菌菌株由分離自不同寄主的不同專化型組成,其它種屬菌株均是分離自香蕉和芒果等作物致病菌的單菌落純培養(yǎng),見表1。1.2方法1.2.1感病植株的制備用1.0%NH4NO3,0.5%K2HPO4,0.25%MgSO4,3%葡萄糖培養(yǎng)基接種菌絲后25℃振蕩培養(yǎng)3d,產(chǎn)生的大量菌絲,過濾后于冷凍干燥機上凍干40h。感病植株采自海南省樂東市郊區(qū)蕉園,分別取其根、球莖、假莖和葉片0.1g提取模板DNA。病組織及干燥后的菌絲體經(jīng)液氮研磨成粉狀。1.2.2sds-ctab法取20mg菌絲或組織干粉于2.0mL離心管中,加入400μL65℃預熱提取緩沖液(50mmol·L-1Tris-HCl,pH8.0;1.0mol·L-1NaCl;50mmol·L-1EDTA;1%PVP)懸浮干粉,混勻,加入終濃度為2%的10%SDS(約80μL),65℃溫育30~40min。12000g4℃離心10min。取上清加入1/5倍體積5×CTAB(5%CTAB;1.0mol·L-1NaCl;50mmol·L-1EDTA,pH8.0;250mmol·L-1Tris-HCl,pH8.0)65℃繼續(xù)溫育10min,冷卻后加苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)反復顛倒充分混勻,12000g4℃離心10min。取上清液,再加等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提。12000g4℃離心10min。在上清液中加入0.6倍體積的預冷無水乙醇沉淀DNA(室溫放置30min),12000g4℃離心10min。取沉淀,加70%乙醇洗2遍,干燥,TE(10mmol·L-1Tris-HCl,pH8.0;0.1mmol·L-1EDTA)溶解DNA,-20℃保存。1.2.3有效引物的設計根據(jù)真菌通用引物ITS1和ITS4擴增的產(chǎn)物克隆測序結果,通過與網(wǎng)上公布的其他鐮刀菌ITS序列的比對,設計一個正向引物FusF1,兩個反向特異引物FusR1和FusR2。測序由大連寶生物基因工程有限公司完成,引物由賽百盛生物工程有限公司合成。1.2.4dntpmitywellPCR擴增反應采用大連寶生物基因工程有限公司TaqDNA聚合酶產(chǎn)品,包括TaKaRaTaqTM5U/μL,10×PCRBuffer(Mg2+Plus),dNTPMixture(含dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)。反應總體積為25μL(18μLddH2O,2.5μLdNTP,2.5μL10×PCRBuffer,0.5μLTaqTM,20pM的引物各0.5μL,模板DNA為25ng),PCR反應在BiometraTgradientPCR儀中進行,擴增體系為94℃預變性4min,94℃變性30s,58℃退火50s,72℃延伸1min,35個循環(huán)后72℃延伸10min,最后于4℃保存。1.2.5瓊脂糖膠電泳PCR擴增反應產(chǎn)物于含有0.3ng/mLGoldViewTM(北京賽百盛基因技術有限公司)的1%瓊脂糖膠上進行電泳,點樣量為5μL反應液和2μLLoadingBuffer,電泳緩沖液為TBE緩沖液(0.089MTris-borat,0.089Mboricacid和0.002MEDTA)。電泳結束后,于紫外成像儀上觀察結果并掃描于計算機軟件中保存。2結果與分析2.1xysporaprapet-pcr檢測gna圖1為兩對引物對引起香蕉枯萎病的病原菌Fusariumoxysporumf.sp.cubense1號和4號生理小種gDNA的PCR擴增反應結果,圖中顯示兩對引物對兩個生理小種都分別有長度大約為300bp和400bp的擴增片段。2.2兩種引物對尖鐮孢菌小種的影響圖2應用兩對引物對鐮刀菌及其它植物病原菌gDNA的PCR擴增結果表明,兩對引物對鐮刀菌屬的尖鐮孢菌小種都有特異性的目的擴增片段,對其它植物致病菌以及鐮刀菌的其它小種無明顯的擴增產(chǎn)物。說明兩對引物對尖鐮刀菌有較高的特異性,但對不同?；偷纳硇》N的區(qū)分能力有限。2.3引物對bg圖3為兩對引物對F1模板DNA稀釋不同倍數(shù)后的PCR反應結果,表明,引物對B模板DNA濃度稀釋到10-5濃度為10pg時有明顯的擴增片斷,引物A在模板濃度為100fg時仍有擴增產(chǎn)物。試驗結果表明引物對目的菌株有著較高的靈敏度,能檢測到較低豐度的目的DNA模板量。2.4引物敏感性對病原菌dna擴增的影響在對感病植株不同組織部位總gDNA的檢測中,兩對引物的敏感性不同,引物A只對病體組織中病根有擴增結果,而引物B則對病根、球莖和假莖低豐度病菌DNA都有特異性的擴增片段,兩個結果清晰,且對寄主基因組DNA無假陽性擴增(見圖4)。3schiing對香蕉的檢測能力和靈敏度應用核糖體rDNA的ITS序列的保守性作為植物病原菌的鑒定檢測手段,已經(jīng)在植物病害的研究中廣泛應用,朱有勇等以ITS序列設計合成的引物能對引起棉花黃萎病的大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)進行有效的分子鑒定和分子檢測;易建平結合線粒體DNA和核糖體DNAITS序列的特異性引物對小麥腥黑穗病的檢測有著較高的檢測靈敏度。KamelA根據(jù)ITS序列設計合成的引物ITS-Fu-f和ITS-Fu-r在對引起棉花枯萎病的病原菌(F.oxysporumf.sp.vasinfectu)檢測?；院挽`敏性做了深入研究。本試驗結果和大量報道均表明,應用核糖體ITS序列設計的引物對病原真菌的檢測有較高的靈敏度,Schiling應用特異性引物對Fusariumculmorum和F.graminearium的檢測下限分別為50pg和5pg,Moricca等對F.oxysporumf.spvasinfectum的檢測下限為50fg~100ng。本試驗中,特異性的引物A在對香蕉鐮刀菌菌絲體基因組的檢測能力較引物B的強(圖3),但是后者卻對感病組織的特異性擴增有著較好的檢測能力(圖4),這可能與香蕉組織中大量的糖和多酚類物質的干擾有關,高靈敏度的特異性引物在對低豐度目標DNA的檢測能力易受各種因素的干擾,如老葉、老莖或根組織的糖、蛋白、次生代謝物,以及土壤腐殖酸等物質的影響。但是,研究同樣指出,ITS擴增的特異性較低,最高只能達到種,較少能達到亞種、專化型和生理小種以下的特異性要求,本試驗中引物對不同?；偷募忡牭毒鷧^(qū)分能力有限,但是田間接種表明其它?；偷木瓴荒芤鹣憬吨虏?所以對一些專化性要求較高病原菌的檢測則需其它輔助的檢測手段,如線粒體DNA序列或一些具有種、亞種以下的特征標記。試驗驗