香蕉枯萎病菌fusariumoxisporum的pcr-pcr檢測(cè)

香蕉枯萎病菌fusariumoxisporum的pcr-pcr檢測(cè)

由于仙童醇苯基乙烯的特殊化型（fusariumoxyspormf.c.c）引起的枯萎，是制約香蕉生產(chǎn)的毀滅性疾病。這是真菌性土壤傳遞的疾病。這種疾病從根本原因而受到影響，導(dǎo)致導(dǎo)管棕褐色和系統(tǒng)感染，整個(gè)植物死亡。現(xiàn)在，中國(guó)對(duì)小品種1號(hào)和4號(hào)造成的破壞最為嚴(yán)重。通常由感病植株的癥狀變化來(lái)鑒定此病,但是產(chǎn)生典型癥狀的植株往往已到發(fā)病后期,而且可能已經(jīng)威脅到其它的植株,因此對(duì)該病的早期檢測(cè)診斷就顯得尤為重要。利用核糖體rDNA序列在物種進(jìn)化中的保守性和易變性,及其在系統(tǒng)發(fā)育中具有種級(jí)以上階元標(biāo)記的特性,設(shè)計(jì)引物,用于植物病害的早期檢測(cè),已經(jīng)在棉花、番茄、西瓜等作物的病害檢測(cè)中得到了應(yīng)用。在香蕉枯萎病的研究中漆艷香、謝藝賢及BentleyS等,利用RAPD-PCR方法對(duì)香蕉枯萎病菌2個(gè)生理小種間的親緣關(guān)系進(jìn)行了研究,劉景梅等建立了廣東香蕉枯萎病菌RAPD分析技術(shù),華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的周鴻飛等也做過(guò)相關(guān)的檢測(cè)研究,但至今尚無(wú)詳細(xì)的文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)致病性鐮刀菌ITS序列的克隆分析,設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物,對(duì)香蕉鐮刀菌枯萎病有較高的靈敏性和特異性。對(duì)香蕉枯萎病的快速檢測(cè)提供了良好的技術(shù)方法,在國(guó)內(nèi)對(duì)于香蕉枯萎病菌的分子檢測(cè)及其感病植株的早期檢測(cè)的報(bào)道尚屬首次。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料供試尖飽鐮刀菌菌株由分離自不同寄主的不同?；徒M成,其它種屬菌株均是分離自香蕉和芒果等作物致病菌的單菌落純培養(yǎng),見表1。1.2方法1.2.1感病植株的制備用1.0%NH4NO3,0.5%K2HPO4,0.25%MgSO4,3%葡萄糖培養(yǎng)基接種菌絲后25℃振蕩培養(yǎng)3d,產(chǎn)生的大量菌絲,過(guò)濾后于冷凍干燥機(jī)上凍干40h。感病植株采自海南省樂(lè)東市郊區(qū)蕉園,分別取其根、球莖、假莖和葉片0.1g提取模板DNA。病組織及干燥后的菌絲體經(jīng)液氮研磨成粉狀。1.2.2sds-ctab法取20mg菌絲或組織干粉于2.0mL離心管中,加入400μL65℃預(yù)熱提取緩沖液(50mmol·L-1Tris-HCl,pH8.0;1.0mol·L-1NaCl;50mmol·L-1EDTA;1%PVP)懸浮干粉,混勻,加入終濃度為2%的10%SDS(約80μL),65℃溫育30~40min。12000g4℃離心10min。取上清加入1/5倍體積5×CTAB(5%CTAB;1.0mol·L-1NaCl;50mmol·L-1EDTA,pH8.0;250mmol·L-1Tris-HCl,pH8.0)65℃繼續(xù)溫育10min,冷卻后加苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)反復(fù)顛倒充分混勻,12000g4℃離心10min。取上清液,再加等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提。12000g4℃離心10min。在上清液中加入0.6倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇沉淀DNA(室溫放置30min),12000g4℃離心10min。取沉淀,加70%乙醇洗2遍,干燥,TE(10mmol·L-1Tris-HCl,pH8.0;0.1mmol·L-1EDTA)溶解DNA,-20℃保存。1.2.3有效引物的設(shè)計(jì)根據(jù)真菌通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆測(cè)序結(jié)果,通過(guò)與網(wǎng)上公布的其他鐮刀菌ITS序列的比對(duì),設(shè)計(jì)一個(gè)正向引物FusF1,兩個(gè)反向特異引物FusR1和FusR2。測(cè)序由大連寶生物基因工程有限公司完成,引物由賽百盛生物工程有限公司合成。1.2.4dntpmitywellPCR擴(kuò)增反應(yīng)采用大連寶生物基因工程有限公司TaqDNA聚合酶產(chǎn)品,包括TaKaRaTaqTM5U/μL,10×PCRBuffer(Mg2+Plus),dNTPMixture(含dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)。反應(yīng)總體積為25μL(18μLddH2O,2.5μLdNTP,2.5μL10×PCRBuffer,0.5μLTaqTM,20pM的引物各0.5μL,模板DNA為25ng),PCR反應(yīng)在BiometraTgradientPCR儀中進(jìn)行,擴(kuò)增體系為94℃預(yù)變性4min,94℃變性30s,58℃退火50s,72℃延伸1min,35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min,最后于4℃保存。1.2.5瓊脂糖膠電泳PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物于含有0.3ng/mLGoldViewTM(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)的1%瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳,點(diǎn)樣量為5μL反應(yīng)液和2μLLoadingBuffer,電泳緩沖液為TBE緩沖液(0.089MTris-borat,0.089Mboricacid和0.002MEDTA)。電泳結(jié)束后,于紫外成像儀上觀察結(jié)果并掃描于計(jì)算機(jī)軟件中保存。2結(jié)果與分析2.1xysporaprapet-pcr檢測(cè)gna圖1為兩對(duì)引物對(duì)引起香蕉枯萎病的病原菌Fusariumoxysporumf.sp.cubense1號(hào)和4號(hào)生理小種gDNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果,圖中顯示兩對(duì)引物對(duì)兩個(gè)生理小種都分別有長(zhǎng)度大約為300bp和400bp的擴(kuò)增片段。2.2兩種引物對(duì)尖鐮孢菌小種的影響圖2應(yīng)用兩對(duì)引物對(duì)鐮刀菌及其它植物病原菌gDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果表明,兩對(duì)引物對(duì)鐮刀菌屬的尖鐮孢菌小種都有特異性的目的擴(kuò)增片段,對(duì)其它植物致病菌以及鐮刀菌的其它小種無(wú)明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物。說(shuō)明兩對(duì)引物對(duì)尖鐮刀菌有較高的特異性,但對(duì)不同專化型的生理小種的區(qū)分能力有限。2.3引物對(duì)bg圖3為兩對(duì)引物對(duì)F1模板DNA稀釋不同倍數(shù)后的PCR反應(yīng)結(jié)果,表明,引物對(duì)B模板DNA濃度稀釋到10-5濃度為10pg時(shí)有明顯的擴(kuò)增片斷,引物A在模板濃度為100fg時(shí)仍有擴(kuò)增產(chǎn)物。試驗(yàn)結(jié)果表明引物對(duì)目的菌株有著較高的靈敏度,能檢測(cè)到較低豐度的目的DNA模板量。2.4引物敏感性對(duì)病原菌dna擴(kuò)增的影響在對(duì)感病植株不同組織部位總gDNA的檢測(cè)中,兩對(duì)引物的敏感性不同,引物A只對(duì)病體組織中病根有擴(kuò)增結(jié)果,而引物B則對(duì)病根、球莖和假莖低豐度病菌DNA都有特異性的擴(kuò)增片段,兩個(gè)結(jié)果清晰,且對(duì)寄主基因組DNA無(wú)假陽(yáng)性擴(kuò)增(見圖4)。3schiing對(duì)香蕉的檢測(cè)能力和靈敏度應(yīng)用核糖體rDNA的ITS序列的保守性作為植物病原菌的鑒定檢測(cè)手段,已經(jīng)在植物病害的研究中廣泛應(yīng)用,朱有勇等以ITS序列設(shè)計(jì)合成的引物能對(duì)引起棉花黃萎病的大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)進(jìn)行有效的分子鑒定和分子檢測(cè);易建平結(jié)合線粒體DNA和核糖體DNAITS序列的特異性引物對(duì)小麥腥黑穗病的檢測(cè)有著較高的檢測(cè)靈敏度。KamelA根據(jù)ITS序列設(shè)計(jì)合成的引物ITS-Fu-f和ITS-Fu-r在對(duì)引起棉花枯萎病的病原菌(F.oxysporumf.sp.vasinfectu)檢測(cè)?；院挽`敏性做了深入研究。本試驗(yàn)結(jié)果和大量報(bào)道均表明,應(yīng)用核糖體ITS序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)病原真菌的檢測(cè)有較高的靈敏度,Schiling應(yīng)用特異性引物對(duì)Fusariumculmorum和F.graminearium的檢測(cè)下限分別為50pg和5pg,Moricca等對(duì)F.oxysporumf.spvasinfectum的檢測(cè)下限為50fg~100ng。本試驗(yàn)中,特異性的引物A在對(duì)香蕉鐮刀菌菌絲體基因組的檢測(cè)能力較引物B的強(qiáng)(圖3),但是后者卻對(duì)感病組織的特異性擴(kuò)增有著較好的檢測(cè)能力(圖4),這可能與香蕉組織中大量的糖和多酚類物質(zhì)的干擾有關(guān),高靈敏度的特異性引物在對(duì)低豐度目標(biāo)DNA的檢測(cè)能力易受各種因素的干擾,如老葉、老莖或根組織的糖、蛋白、次生代謝物,以及土壤腐殖酸等物質(zhì)的影響。但是,研究同樣指出,ITS擴(kuò)增的特異性較低,最高只能達(dá)到種,較少能達(dá)到亞種、?；秃蜕硇》N以下的特異性要求,本試驗(yàn)中引物對(duì)不同?；偷募忡牭毒鷧^(qū)分能力有限,但是田間接種表明其它?；偷木瓴荒芤鹣憬吨虏?所以對(duì)一些專化性要求較高病原菌的檢測(cè)則需其它輔助的檢測(cè)手段,如線粒體DNA序列或一些具有種、亞種以下的特征標(biāo)記。試驗(yàn)驗(yàn)