基于微衛(wèi)星位點(diǎn)的家兔遺傳多樣性分析

基于微衛(wèi)星位點(diǎn)的家兔遺傳多樣性分析

中國的兔子生產(chǎn)已有2000多年的歷史，并培育了適合不同自然條件的兔子品種。目前已成為世界養(yǎng)兔最多的國家,兔肉、兔毛出口量最大。但是,近些年來不少養(yǎng)殖場為了追求經(jīng)濟(jì)利益而對家兔進(jìn)行連續(xù)定向選擇,而且利用的親本數(shù)目有限,致使群體遺傳結(jié)構(gòu)逐漸改變,總體遺傳多樣性下降,最終導(dǎo)致種質(zhì)退化。因此了解目前我國家兔資源的遺傳多樣性狀況及如何最大限度地保持其遺傳多樣性已成為家兔育種者關(guān)注的問題。近幾年國內(nèi)、外學(xué)者已經(jīng)通過形態(tài)標(biāo)記、生化標(biāo)記、分子標(biāo)記等方法對某些家兔品種進(jìn)行了遺傳多樣性評價(jià)(杜立新,1995;Chantry-Darmonetal.,2005,2006)。自聯(lián)合國糧農(nóng)組織將微衛(wèi)星標(biāo)記作為優(yōu)先推薦的分析工具以來(Barkeretal.,1997),國內(nèi)學(xué)者也開始利用微衛(wèi)星對部分家兔的遺傳多樣性進(jìn)行了分析:樊兆斌等(2007)利用微衛(wèi)星標(biāo)記對我國的5個引進(jìn)品種的遺傳多樣性進(jìn)行了分析;朱玉峰等(2004a,b)對獺兔等幾個品種的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系進(jìn)行了分析。但目前已有的這些研究均未系統(tǒng)地闡述我國目前飼養(yǎng)家兔品種的遺傳多樣性問題,不能對我國家兔資源進(jìn)行總體評價(jià)。因此本文采用微衛(wèi)星標(biāo)記對我國飼養(yǎng)的22個家兔群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析,以期揭示家兔的遺傳多樣性現(xiàn)狀,為家兔種質(zhì)資源的有效保護(hù)和合理利用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1引物的選擇及合成本實(shí)驗(yàn)樣本采自22個家兔品種,每個品種隨機(jī)采集約60只(公母各半),要求采樣個體具備品種的典型特征,共計(jì)1,300只個體(表1)。耳緣靜脈采血3–5mL,ACD抗凝,–80℃保存。從30對引物中選擇10對多態(tài)性較高的位點(diǎn),引物由華美生物工程公司合成。該10對引物的信息見表2。1.2分子克隆實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)的酚氯仿抽提法。具體參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第3版)。用分光光度計(jì)測定基因組DNA溶液的濃度,然后將濃度調(diào)整為50ng/μL左右。1.3pcr檢測taq酶和dntps的表達(dá)25μL反應(yīng)體系:10×buffer緩沖液(含Mg2+)2.5μL,4種dNTPs混合物(2.5mM)2μL,引物(25μM/L)1μL,Taq聚合酶(–20℃保存)1μL,模板DNA1μL,滅菌的蒸餾水17.5μL。Taq酶和dNTPs均購自上海生工生物工程公司。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,54–67℃退火30s,72℃延伸30s,進(jìn)行35個循環(huán);72℃延伸7min。1.4變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先在2.0%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測,然后用12%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分型。采用PBR322/MspI作為分子量標(biāo)記物(Hiteetal.,1996)。1.5計(jì)算機(jī)軟件分析本研究采用POPGEN3.2統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算等位基因頻率、雜合度(H)和有效等位基因數(shù)(Ne)(Garzaetal.,1995),并以等位基因頻率為基礎(chǔ),利用SAS軟件計(jì)算多態(tài)信息含量,利用DISPAN軟件計(jì)算Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(DS)。根據(jù)遺傳距離利用PHYLIP軟件對所研究的群體進(jìn)行聚類分析(張繼全等,1998)。2結(jié)果2.1吉戎-i、c、pb各研究群體遺傳信息比較22個家兔群體在10個微衛(wèi)星座位上的平均有效等位基因數(shù)為3.0–4.6。平均多態(tài)信息含量(PIC)在0.4997–0.7009之間,加利福尼亞兔最低(0.4997),吉戎-I系最高(0.7009)。除加利福尼亞兔為中度多態(tài)(0.25<PIC=0.4997<0.5)外,其余為高度多態(tài)(PIC>0.5),表明本研究的所有研究群體提供的遺傳信息均較高,有較大的利用潛力。觀察雜合度在0.4884–0.9035之間,期望雜合度在0.5885–0.7378之間,其中有6個群體觀察雜合度低于期望雜合度(表3)。2.2群體間的遺傳變化2.2.1群體遺傳分化系數(shù)10個微衛(wèi)星位點(diǎn)總?cè)后w雜合度和亞群體雜合度分別為0.7587和0.6526,群體的遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.1398,即遺傳變異的13.98%存在于品種間,86.02%的存在于品種內(nèi)。2.2.2群體間遺傳距離分析根據(jù)Nei’s計(jì)算DS遺傳距離(Neietal.,1983)(表4),可以看出我國家兔各品種之間的遺傳距離較近,在0.0087–1.2712之間。其中以美系獺兔和德系獺兔間距離最近,為0.0087,德國大白兔與長毛兔之間距離最遠(yuǎn),為1.2712。由群體間遺傳距離分析得到的UPGMA聚類圖能夠更直觀地體現(xiàn)群體間關(guān)系。系統(tǒng)進(jìn)化樹把22個家兔群體分為3大類。首先由吉林大學(xué)培育的吉戎-Ⅰ系和吉戎-Ⅱ系兔自成一類,塞北兔、哈白兔聚為一類,其他品種通過多次聚類之后聚為一大類(圖1)。3討論3.1布列塔尼亞兔的多樣性本研究結(jié)果表明中國現(xiàn)有家兔群體的遺傳多樣性較為豐富,具有較大的保種潛力。布列塔尼亞兔的雜和度最高,因此,其遺傳多樣性最豐富,這可能與它的培育歷史有關(guān),布列塔尼亞兔是由比利時兔、公羊兔、青紫藍(lán)兔、花巨兔、蘇聯(lián)白免、德國白兔、新西蘭白兔、加利福尼亞兔等幾個品種雜交而成的。塞北兔的遺傳多樣性最低,我們推測可能是長期的地理隔離和生殖隔離,加之群體數(shù)量較小,導(dǎo)致群體的同質(zhì)性加大。3.2品種期望雜合度及種群內(nèi)、分期望雜合度是從一個基因庫中隨機(jī)抽出的一個位點(diǎn)的兩個拷貝為非純合基因的概率。此雜合度值越大表明群體內(nèi)的遺傳變異越大;觀察雜合度是所有位點(diǎn)在各個品種中實(shí)際出現(xiàn)的雜合度。觀察雜合度值越接近期望雜合度值說明該品種受外來選擇及近交等因素的影響越小,群體處于遺傳平衡狀態(tài)(張繼全等,1998)。中國現(xiàn)有22個品種中,多數(shù)品種期望雜合度與觀察雜合度之間的差異都較小,群體處于遺傳平衡狀態(tài),如福建黃兔和江西萬載兔的觀察雜合度與期望雜合度分別只相差0.097和0.095(表3),說明福建黃兔和江西萬載兔在品種培育過程中受外來選擇及近交的影響較小,更接近于原始品種。6個群體的平均觀察雜合度明顯低于期望雜合度,暗示群體內(nèi)可能存在一定程度的近交。一方面在相近生態(tài)區(qū)域內(nèi),家兔品種分布界線有時不太分明,尤其是市場交易過程中基因交流機(jī)會較多,易表現(xiàn)出純合化效應(yīng)(陳幼春,2001)。另一方面,當(dāng)種群數(shù)量較少時,公兔血統(tǒng)來源比較單一,會造成近交程度不斷升高,致使微衛(wèi)星基因座有效等位基因數(shù)目較少、觀察雜合度較低(李寧,2002;Zerger&Richarderson,2003),如太行山兔就是由于種群數(shù)量較少時,公兔血統(tǒng)來源比較單一,造成近交程度較高。3.3發(fā)展中長毛兔育種本研究運(yùn)用UPGMA得出的聚類結(jié)果與家兔的地理分布或育種成史相吻合。如:長毛兔為毛用兔,與其他群體交流較少(1),因此與國內(nèi)其他群體間的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。與龍繼蓉(2001)利用mtDNA技術(shù)對我國家兔品種遺傳多樣性分析結(jié)果中長毛兔與其他品種的遺傳距離較遠(yuǎn)基本上相一致。德國大白兔與長毛兔間的遺傳距離最遠(yuǎn),所以在育種實(shí)踐中可充分發(fā)揮它們的雜交優(yōu)勢進(jìn)行配套利用,培育新品種(系),以提高我國家兔品種的生產(chǎn)性能。在聚類圖中22個家兔品種被分為3大類,其中吉戎-Ⅰ系和吉戎-Ⅱ系兔聚為一類,這可以從它們的培育過程得到解釋。吉戎-Ⅰ系是利用日本大耳白兔為母本、加利福尼亞短毛型的公獺兔為父本,在“八黑”短毛型純合體中進(jìn)行繼代選育,后經(jīng)5個世代選育而成。用于吉戎-Ⅱ系選育的父、母本與吉戎-Ⅰ系相同,只是選育出白花短毛型進(jìn)行繼代選育,所以二者親緣關(guān)系最近,只是選育方向不同。吉戎-Ⅰ系與吉戎-Ⅱ系聚為一類與龐榮清等(2000)利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析,樊兆斌等(2007)利用微衛(wèi)星分析所得的結(jié)論一致。3.4改變構(gòu)的近交表現(xiàn)我國家兔資源較為豐富,但塞北兔等個別群體遺傳多樣性較低,通過觀察雜合度及期望雜合度對群體結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn),長期以來對優(yōu)良性狀的選擇育種已使家兔的群體結(jié)構(gòu)有所改變,并表現(xiàn)出不同程度的近交。因此,為了避免群體結(jié)構(gòu)的改變,改變?nèi)后w的遺傳平衡,減少不