第八章 動(dòng)物基因工程

第八章

動(dòng)物基因工程動(dòng)物基因工程是利用DNA重組技術(shù)對(duì)動(dòng)物所進(jìn)行的工程操作。從遺傳學(xué)角度分為：遺傳性動(dòng)物基因工程：外源基因能夠通過配子進(jìn)行垂直傳遞并穩(wěn)定的遺傳。非遺傳性動(dòng)物基因工程：轉(zhuǎn)基因僅在當(dāng)代表現(xiàn)，不能夠遺傳給子代。第一節(jié)動(dòng)物基因工程的發(fā)展?fàn)顩r與趨勢

動(dòng)物基因工程的實(shí)質(zhì)是改變動(dòng)物的遺傳組成，增加動(dòng)物的遺傳多樣性，賦予轉(zhuǎn)基因動(dòng)物新的表型特征，使能夠更好地服務(wù)與人類社會(huì)。世界首只轉(zhuǎn)基因靈長類動(dòng)物

——-安迪世界第一只轉(zhuǎn)基因動(dòng)物熒光魚轉(zhuǎn)基因兔轉(zhuǎn)基因兔鼠據(jù)英國媒體4日報(bào)道，英國第四頻道電視臺(tái)將在一個(gè)新的電視節(jié)目秀中披露一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物農(nóng)場中的眾多驚人內(nèi)幕：在那個(gè)農(nóng)場中，綿羊長著人心臟、山羊會(huì)吐蜘蛛絲、奶牛尺寸是普通牛的3倍大，而豬則會(huì)在黑暗中發(fā)光！據(jù)英國第四頻道電視主任凱文·利戈稱，他們拍攝下來的農(nóng)場中的所有轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，全都真實(shí)存在，而非科幻電影中的虛構(gòu)場景。轉(zhuǎn)基因細(xì)菌可治癌癥

英國醫(yī)學(xué)專家日前將轉(zhuǎn)基因大腸桿菌與一種抗癌藥相結(jié)合，成功殺死了實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)的癌細(xì)胞?？茖W(xué)家將轉(zhuǎn)基因大腸桿菌注射到實(shí)驗(yàn)鼠的腫瘤內(nèi)，再給實(shí)驗(yàn)鼠注射一種名叫6－MPDR的抗癌藥。這種藥無法單獨(dú)發(fā)揮作用，但是一種由轉(zhuǎn)基因大腸桿菌分泌的酶能將此藥物“激活”，形成一種有效的毒素，將其周圍的癌細(xì)胞殺死，而不傷害其它組織器官。

據(jù)路透社11月8日報(bào)道，日本科學(xué)家已經(jīng)培育了一種新的基因改良老鼠，它們不具備感知危險(xiǎn)氣味的能力，因此，對(duì)其死對(duì)手貓一點(diǎn)都不覺得害怕，相反還大膽地在貓身上爬來爬去，甚至偎依在貓身邊。此研究發(fā)表在7日出版的《自然》雜志上。文章的第一作者，東京大學(xué)的Takashi

Sakudoh說：“對(duì)蠶的色素傳輸系統(tǒng)的了解，使得我們有可能通過基因調(diào)控來控制蠶絲的顏色和色素比例?！?/p>

自然界中，蠶繭的顏色有白色、黃色、稻草色、橙紅色、粉紅色和綠色。絲綢的顏色來自于桑蠶吃桑樹葉時(shí)對(duì)自然色素的吸收。

從轉(zhuǎn)基因的技術(shù)手段來看，除DNA顯微注射法外，人們先后試過反轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)法、精子介導(dǎo)法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法和核移植法等多種轉(zhuǎn)基因方法。

轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的核移植技術(shù)已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的主流方法。1、從簡單的顯微注射法向高效率的轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植方向發(fā)展轉(zhuǎn)基因在基因組中的存在方式有兩種，即隨機(jī)整合和定點(diǎn)整合。為了達(dá)到外源基因的高效表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)上增加了含有位點(diǎn)控制區(qū)（LCR）、核基質(zhì)附著區(qū)(MAR)等調(diào)控元件，可以實(shí)現(xiàn)插入位點(diǎn)非依賴性、拷貝數(shù)相關(guān)的表達(dá)模式。LCR和MAR的功能不受種屬差異的限制，無論外源基因插入什么位點(diǎn)，都能夠維持一個(gè)開放的染色體結(jié)構(gòu)，有利于基因的表達(dá)?；虼虬屑夹g(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目的基因的定位操作。2、從外源基因隨機(jī)插入(或整合)到定點(diǎn)整合的轉(zhuǎn)變

從轉(zhuǎn)基因的策略來看，動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了兩個(gè)階段：第一階段為傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物階段，第二階段為條件性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物階段。借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)可將單一的功能基因和基因簇引入高等動(dòng)物的基因組，或?qū)⒛康幕驈膭?dòng)物基因組中敲除，實(shí)現(xiàn)了種系內(nèi)和種系間基因轉(zhuǎn)移或修飾，產(chǎn)生新的基因型和表型。目前轉(zhuǎn)基因動(dòng)物主要應(yīng)用在生物學(xué)基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)疾病模型、動(dòng)物生物反應(yīng)器、異種器官移植、動(dòng)物遺傳改良等５個(gè)方面。３、從傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因到條件控制的轉(zhuǎn)變

第二節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)一、動(dòng)物基因工程載體二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)一、動(dòng)物基因工程載體作為動(dòng)物基因工程載體必須具備以下幾個(gè)功能：

為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力為外源基因提供在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制或整合的能力為外源基因提供在受體細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增和表達(dá)能力載體可分為:質(zhì)粒型表達(dá)載體病毒載體定向打靶載體1.質(zhì)粒型表達(dá)載體表達(dá)載體的共同特點(diǎn)是都帶有原核復(fù)制區(qū)和選擇性標(biāo)記基因，保證重組DNA分子能夠在大腸桿菌中擴(kuò)增，同時(shí)也必須包括能在真核細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)組件。一般包括轉(zhuǎn)錄外源DNA序列的啟動(dòng)元件、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有效地加上poly（A）尾巴所必需的信號(hào)序列、真核細(xì)胞中的選擇性標(biāo)記，另外還增加了一些附加元件，如增強(qiáng)子、內(nèi)含子、剪接供體與受點(diǎn)，以保證外源基因的高效表達(dá)。以山羊乳腺特性表達(dá)載體pBC1為例2.病毒載體作為基因轉(zhuǎn)移的病毒載體須具備以下基本條件：攜帶外源基因并能夠包裝成病毒顆粒介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移與表達(dá)對(duì)機(jī)體不致病（1）腺病毒（adenovirus）

腺病毒作為轉(zhuǎn)染載體有許多特點(diǎn)：基因組的重排率低外源基因與病毒DNA重組后能遺傳幾個(gè)周期安全性好，不會(huì)整合到人的染色體上，不導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生宿主范圍廣，對(duì)受體細(xì)胞是否處于分裂期要求不高外源基因在載體上容易高效表達(dá)（2）腺相關(guān)病毒（AAV）

腺相關(guān)病毒是一種天然復(fù)制缺陷型非致病性單鏈DNA病毒，其復(fù)制需要有輔助病毒的共轉(zhuǎn)染。無共轉(zhuǎn)染時(shí)，野生型AAV優(yōu)先（70%）整合在人染色體的19q13.3位點(diǎn)處，潛伏存在直至被輔助病毒拯救出來。其整合需要基因組兩端的ITR，以及非結(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白R(shí)ep78和Rep68的存在。

AAV具有以下幾個(gè)方面特點(diǎn)：非致病性、無免疫原性和無炎癥反應(yīng)能感染靜止期的細(xì)胞，如神經(jīng)元細(xì)胞插入的外源基因表達(dá)時(shí)間長，可達(dá)到1年之多宿主范圍廣熱穩(wěn)定性強(qiáng)，容易通過滅活輔助腺病毒純化（3）反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄病毒是一種整合型單鏈RNA病毒，感染宿主細(xì)胞后，病毒顆粒中的pol基因表達(dá)出反轉(zhuǎn)錄酶，以單鏈的RNA基因組為模板，立即轉(zhuǎn)錄出一份線形雙鏈DNA復(fù)本，然后在整合酶（Int）介導(dǎo)下，整合到宿主的基因組內(nèi)，此時(shí)整和的病毒序列被稱為前病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒基因組整合到宿主細(xì)胞基因組后，其DNA隨宿主DNA的復(fù)制而復(fù)制，并由5`-LTR中的一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄出病毒RNA鏈，它既是病毒基因組，同時(shí)又具有mRNA模板活性，翻譯出結(jié)構(gòu)蛋白和反轉(zhuǎn)錄酶。在宿主細(xì)胞質(zhì)中，兩條相同的RNA鏈和反轉(zhuǎn)錄酶被包裝與內(nèi)殼中，形成的成熟病毒顆粒以芽植方式分泌至細(xì)胞外，但通常不致死宿主細(xì)胞。3.定向打靶載體基因打靶是通過外源基因與靶細(xì)胞染色體上的同源序列間的同源重組，將外源基因定點(diǎn)整合到靶細(xì)胞特定位置上，而使某一個(gè)特定位點(diǎn)上的基因發(fā)生定點(diǎn)突變的技術(shù)。在細(xì)胞內(nèi)存在兩條相同的DNA鏈（同源染色體），在細(xì)胞內(nèi)酶的作用下，可以將其切開，發(fā)生交叉，然后重新連接，從而發(fā)生DNA鏈的交換并引發(fā)重組。（1）基因敲除

敲除型載體由兩段與基因組內(nèi)靶基因座序列同源的DNA片段（又稱同源臂）組成，中間為正向選擇標(biāo)記，同緣臂外側(cè)為真核細(xì)胞中的負(fù)選擇標(biāo)記及在原核細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制與篩選的載體DNA序列。（2）基因敲入基因敲入是利用同源重組原理將外源基因插入到染色體的特定位點(diǎn)上?；蚯萌氲霓D(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上相似于基因敲除結(jié)構(gòu)，但區(qū)別在于：或用外源基因替換并失活靶基因、或在不影響拔基因功能的前提下插入新的基因、或在染色體上特定位點(diǎn)插入新的外源基因，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，并使得外源基因高效表達(dá)（3）基因下調(diào)（knock-down）

RNA干擾（RNAi）又被稱為基因下調(diào)，通過干擾RNA（siRNA）分子的作用達(dá)到轉(zhuǎn)錄后基因沉默的效應(yīng)。

siRNA的制備方法主要包括體外合成siRNA和siRNA表達(dá)載體兩種。體外合成的siRNA易轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞后，可直接發(fā)揮作用，一般不存在siRNA表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄效率低及細(xì)胞毒性等問題。但是體外合成的siRNA只能瞬間干擾，不能達(dá)到長久抑制病毒的效果。

二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)物理轉(zhuǎn)染法化學(xué)轉(zhuǎn)染法生物法1.物理轉(zhuǎn)染法

（1）電擊法（electroporation）其基本原理是在外加電場的作用下，細(xì)胞膜電位發(fā)生改變，細(xì)胞質(zhì)膜瞬間出現(xiàn)可逆性的電穿孔，從而使一定數(shù)量的外源DNA從細(xì)胞外擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，并進(jìn)一步整合到宿主DNA上，達(dá)到轉(zhuǎn)基因目的。利用點(diǎn)穿孔法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移（2）顯微注射法

將外源DNA在顯微鏡操作系統(tǒng)的輔助下，通過玻璃微管直接將外源DNA注入哺乳動(dòng)物受精卵的原核內(nèi)，使外源基因整合到基因組上，制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。（3）基因槍法

基本原理是將要轉(zhuǎn)染的DNA吸附到高黏度的金屬（鎢或金等）顆粒上，在一種加速裝置的作用下，將這些粒子高速打入細(xì)胞或組織內(nèi)，達(dá)到轉(zhuǎn)基因目的（4）超聲波法（sonoporation）

超聲波增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染法的主要機(jī)制是聲波的空化效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞的通透性增高，而通過添加超生造影劑能降低空化域值，增強(qiáng)空化效應(yīng)，促進(jìn)外源基因進(jìn)入細(xì)胞，提高基因的轉(zhuǎn)染效果2.化學(xué)轉(zhuǎn)染法（1）磷酸鈣法

將待轉(zhuǎn)染的DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2后，DNA片段與磷酸鈣共沉淀并形成大的顆粒；將此顆粒懸浮液加入貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞中，外源DNA就被靶細(xì)胞所吸收，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因。

利用磷酸鈣共沉淀法進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)染質(zhì)脂體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移（2）脂質(zhì)體法（lipofection）將待轉(zhuǎn)染的DNA溶液與磷脂混合，后者在表面活性劑存在下形成包埋水相DNA的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。當(dāng)這種脂質(zhì)體懸液加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，便會(huì)與受體細(xì)胞膜發(fā)生融合，DNA片段隨即進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)。（3）原生質(zhì)體融合法

含有目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌或酵母細(xì)胞。大量擴(kuò)增，利用溶菌酶或蝸牛酶去除胞壁部分，在高鹽條件下制成原生質(zhì)體，然后散鋪在單層培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞上，在融和劑（如聚乙二醇）作用下，使染色體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)如細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因

構(gòu)建含有選擇性標(biāo)記的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組部分DNA與質(zhì)粒的雜合型載體分子，在多克隆位點(diǎn)插入外源基因形成重組DNA分子，克隆到大腸桿菌中擴(kuò)增鑒定；重組DNA分子通過物理或化學(xué)方法轉(zhuǎn)入一個(gè)特制的病毒包裝細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染入包裝細(xì)胞系的重組DNA轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的重組RNA分子，包裝細(xì)胞系分泌出來的重組反轉(zhuǎn)錄病毒，便可感染其他類型動(dòng)物受體細(xì)胞，重組RNA分子以DNA形式整合到染色體上，并表達(dá)外源基因。3.病毒感染法

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體穩(wěn)定、長期表達(dá)外源基因

原病毒DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)包裝細(xì)胞中，包裝原病毒產(chǎn)生將病毒RNA包裝成感染性病毒粒子的所有蛋白質(zhì)，但卻不能包裝自身的RNA第三節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備程序轉(zhuǎn)基因鑒定表達(dá)水平的檢測轉(zhuǎn)基因動(dòng)物傳代與檢測一轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備程序DNA顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因牛1、DNA顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠超數(shù)排卵

基因制備

胚胎移植顯微注射

轉(zhuǎn)基因個(gè)體的鑒定

顯微注射技術(shù)2、胚胎干細(xì)胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠

胚胎干細(xì)胞是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出的未分化、具有正常二倍體染色體和發(fā)育全能性的細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：

可以在體外進(jìn)行人工培養(yǎng)、長期擴(kuò)增、冷凍保存胚胎干細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物過程（1）轉(zhuǎn)基因胚胎干細(xì)胞的獲得（2）囊胚注射（3）嵌合體的檢測和育種

胚胎干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)化法(引自G1ick&Pasternak，1998)判斷是否是種系嵌合

首先用轉(zhuǎn)基因嵌合體的小鼠與正常的小鼠交配，對(duì)其后代進(jìn)行檢測，如果后代中有轉(zhuǎn)基因個(gè)體出現(xiàn)，證明為種系嵌合，然后將轉(zhuǎn)基因雜合子個(gè)體進(jìn)行橫交就會(huì)獲得轉(zhuǎn)基因純合子和雜合子個(gè)體。如果在后代中沒能發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因純合子，應(yīng)注意是否因?yàn)檗D(zhuǎn)基因的純合造成了胚胎的早期死亡，無法得到成活個(gè)體所致。基因的準(zhǔn)備供體細(xì)胞獲取傳代培養(yǎng)、擴(kuò)增供體細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因

轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞的篩選與擴(kuò)增卵母細(xì)胞的獲得體外成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞的去核核移植重構(gòu)胚體外培養(yǎng)胚胎移植獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體3、轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因牛步驟一：從一只６歲芬蘭多塞特白面母綿羊（姑且稱為Ａ）的乳腺中取出乳腺細(xì)胞，將其放入低濃度的營養(yǎng)培養(yǎng)液中，細(xì)胞逐漸停止分裂，此細(xì)胞稱之為“供體細(xì)胞