微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告

功效微生物的篩選、培養(yǎng)與選育生科院09012109091711月30日概要：以產(chǎn)抗生素細(xì)菌的篩選和選育為目的，通過(guò)培養(yǎng)基制備及滅菌、菌種的分離純化、菌種的鑒定、培養(yǎng)條件的優(yōu)化以及誘變育`種五個(gè)實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)有關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和辦法.核心詞：分離純化、滅菌、酶活性、誘變一、材料與辦法：1.11牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制配方（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，瓊脂20，pH7.0～7.2。注：配制3000mL，分裝20支固體斜面試管（不超出試管高度的1/3）和20支液體試管（不超出試管高度的1/3），其它分裝于1L三角瓶，每瓶500mL。不同pH值配制1(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5pH4.0

配制2(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5pH7.2不同碳源

配制3：淀粉3g，蛋白胨10g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O1.5g，去離子水1000mLpH7.2

配制4：葡萄糖3g，蛋白胨10g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O1.5g，去離子水1000mLpH7.2不同氮源

配制5：硝酸鈉10g，葡萄糖3g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O1.5g，去離子水1000mLpH7.2

配制6：蛋白胨10g，葡萄糖3g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O1.5g，去離子水1000mLpH7.21.12無(wú)菌水的準(zhǔn)備50ml三角瓶?jī)?nèi)盛入18ml蒸餾水，放入8～10顆玻璃小珠，加蓋瓶塞，包扎待滅菌；50ml三角瓶?jī)?nèi)盛入18-20ml蒸餾水，加蓋瓶塞，包扎待滅菌；1.13滅菌材料與器皿的包扎1.試管的包扎：7支試管為一包扎單位，用報(bào)紙將試管塞部分包扎嚴(yán)實(shí)并繩之以紗線；2.三角瓶的包扎：用報(bào)紙將瓶塞部分包扎嚴(yán)密，并以紗線系之；3.培養(yǎng)皿的包扎：6個(gè)平皿為一包扎單位，用報(bào)紙以滾筒方式將其包緊；4.玻璃移液管的包扎：每1支吸管為包扎單位，用細(xì)長(zhǎng)條報(bào)紙以卷煙方式扎之5.1.5mL離心管的包扎：6個(gè)離心管為包扎單位，用報(bào)紙包成小包。固體斜面的擺放注：斜面長(zhǎng)度不超出試管長(zhǎng)度的1/21.14滅菌首先將含有培養(yǎng)基的三角瓶和試管放入滅菌鍋，注意不要讓培養(yǎng)基傾斜以防溢出，然后再放入其它的玻璃器材。滅菌物品之間不要擺放太擠，以確保高壓蒸汽滅菌能夠徹底。1.21土壤樣品的采集

在國(guó)教中心前取土，天氣晴朗，用取樣鏟，將表層5cm左右的浮土除去，取5～25cm處的土樣10～25g，裝入事先準(zhǔn)備好的滅菌信封內(nèi)。1.22制備土壤稀釋液：

稱取土壤2g，放入18mL帶有玻璃珠的無(wú)菌水三角瓶中，振蕩5min，即為稀釋10－1的土壤懸液，土壤懸液80℃水浴加熱10分鐘，然后在離心管中依次稀釋至10-2、10-3等稀釋度。1.23制備淀粉培養(yǎng)基平板制5塊牛膏蛋胨培養(yǎng)基平板

具體制法為：倒入融化好的淀粉瓊脂培養(yǎng)基（溫度為不燙手為宜）并輕輕搖晃混勻，置于桌面冷卻為平板。

在無(wú)菌培養(yǎng)皿底部注明個(gè)人信息（分離菌名、稀釋度、組別、班級(jí)）。1.24a吸取稀釋液

無(wú)菌操作法分別吸取10－1、10－2、10－3土壤稀釋液0.1mL，分別加在已制好的3塊淀粉平板培養(yǎng)基上。b涂板

用玻璃刮鏟將稀釋液在培養(yǎng)機(jī)上充足混勻鋪平，倒置于恒溫箱培養(yǎng)。1.25培養(yǎng)置于504房間30℃培養(yǎng)24小時(shí)。1.26觀察水解圈的產(chǎn)生并測(cè)其半徑。a、48小時(shí)后，在之前稀釋涂布的三塊淀粉培養(yǎng)基上選用典型的單個(gè)菌落，并用記號(hào)筆在平板背面進(jìn)行編號(hào)。然后將編號(hào)后的菌落用無(wú)菌牙簽挑取，在備用的淀粉培養(yǎng)基平板上分別劃線接種（編號(hào)與被挑菌落相似）b、將碘液滴加在之前稀釋涂布的三塊淀粉培養(yǎng)基上，觀察與否有水解圈的產(chǎn)生，并測(cè)量其半徑。c、根據(jù)水解圈的有無(wú)以及大小鑒定有關(guān)菌落與否產(chǎn)生淀粉酶，并統(tǒng)計(jì)該菌落編號(hào)，并將接種有分離平板上菌落的備用淀粉瓊脂平板冰箱保存留作后續(xù)實(shí)驗(yàn)之用。1.27菌種活化在1.28前的48h將平板菌種接入牛肉膏蛋白胨液體試管活化，并接種一支斜面試管保藏。提前18h按0.2％接種量分別轉(zhuǎn)接以下五種液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：1牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)2牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基18℃培養(yǎng)3牛肉膏檸檬酸鈉培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)4牛肉膏硝酸鈉培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)5牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基pH430℃培養(yǎng)1.28不同條件對(duì)淀粉酶活性的影響測(cè)定a倒制淀粉培養(yǎng)基平板一塊。培養(yǎng)基倒入量規(guī)定不要太多，盡量薄一點(diǎn)，鋪滿平板底部即可。b用小濾紙片分別蘸取各瓶18小時(shí)培養(yǎng)物少量，規(guī)定不要蘸太多，確保每片所蘸培養(yǎng)物盡量一致c如右圖所示，將小濾紙片貼在淀粉培養(yǎng)基表面，并分別在底板上做上標(biāo)記d將平板置于30℃培養(yǎng)箱作用1h。然后將碘液鋪在平板上，分別測(cè)量水解圈的大小1.29不同條件對(duì)菌體生長(zhǎng)量影響的測(cè)定a將培養(yǎng)18小時(shí)后液體搖瓶培養(yǎng)物分別取出3mL于比色杯中，在721型分光光度計(jì)600nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。如果菌液濃度過(guò)大，可做適宜稀釋后再進(jìn)行測(cè)量。b分別統(tǒng)計(jì)多個(gè)不同培養(yǎng)基和不同培養(yǎng)條件下OD600值大小，評(píng)價(jià)對(duì)菌體生長(zhǎng)量的影響。產(chǎn)淀粉酶菌種的鑒定1.31產(chǎn)淀粉酶待檢菌的培養(yǎng)特性與形態(tài)特性的觀察與鑒定1.培養(yǎng)特性的觀察：菌落形狀與大小，邊沿，表面，隆起形狀，透明度，菌落與培養(yǎng)基顏色等；2.細(xì)菌細(xì)胞的顯微觀察：細(xì)胞形狀是桿狀（長(zhǎng)桿或短桿）還是球狀？有無(wú)芽孢？有無(wú)莢膜？3.細(xì)菌的革蘭氏染色：按照實(shí)驗(yàn)二的操作辦法進(jìn)行（設(shè)立原則的革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌為對(duì)照）。1.32細(xì)菌的16SrDNA分子鑒定反映體系：在一種PCR管中用微量移液槍依次加入列物質(zhì)：Taqbuffer（10×）

2.5μlMgCl2（25mM）1μldNTP（2.5mM）

2.5μlPrimerForward（50mM）

1μlPrimerReverse（50mM）

1μlddH2O

16.5μl用滅菌牙簽挑取單菌落于PCR管中，使菌體懸浮于反映體系中。rTaq（2U/μl）

0.5μlPCR反映條件：95℃預(yù)變性15min后，95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共25個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。1.33瓊脂糖凝膠電泳1.制膠：配制0.7%瓊脂糖溶液20mL，用1×TAE電泳緩沖液做溶劑，加熱溶解，稍冷后，加入模具中，插入梳子，待膠凝固；2.制樣：PCR反映結(jié)束后，取出PCR管，吸取5μl與1μl6×樣品Buffer混合后全部點(diǎn)入浸于TAE電泳緩沖液中的瓊脂糖凝膠的樣品孔中；3.電泳：100V電泳20min；4.染色：將凝膠置于樣品染料溴化乙錠中染色；10min，然后將凝膠置于紫外燈下進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)在凝膠上出現(xiàn)預(yù)期大小的DNA條帶（約1.5Kb），則認(rèn)為是PCR陽(yáng)性，這時(shí)將與此電泳樣品對(duì)應(yīng)的PCR反映管放置冰箱短期保存。1.34PCR擴(kuò)增片段測(cè)序獲得的PCR陽(yáng)性樣品由專人送往測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，大概一周后測(cè)序成果能夠返回，然后在電腦的有關(guān)軟件上進(jìn)行讀序。1.35序列比對(duì)分析使用NCBI網(wǎng)站看待測(cè)菌的16SrDNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中多個(gè)菌的16SrDNA序列進(jìn)行比對(duì)。登陸美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站，使用BLASTn在GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB基因庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索。從Genebank中選擇近與待測(cè)菌目的基因序列同源性最高的已知分類的菌株的16SrRNA基因序列,初步擬定待測(cè)菌的分類位置。用Clustal軟件將已知分類菌株的16SrRNA序列與待測(cè)菌的16SrRNA序列進(jìn)行多序列比較。1.41菌種的活化與接種每組提前40h將分離的產(chǎn)淀粉酶菌株轉(zhuǎn)接至試管斜面，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，每組挑取一環(huán)活化菌株，接種至含10ml淀粉培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，于25℃，150r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)。1.42誘變a.菌懸液的制備取出培養(yǎng)約16h的搖瓶，取0.5ml菌懸液（吸取前三角瓶要搖勻）于離心管中（每組3管），5000r/min離心5min，棄上清液，將菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，加入1.5ml無(wú)菌生理鹽水制成菌懸液。b.平板制作融化淀粉培養(yǎng)基，每組倒4塊平板，在平板上做好標(biāo)記。c.誘變解決(1)啟動(dòng)紫外燈預(yù)熱10-20min。(2)紫外解決：取制備好的菌懸液3mL移入6cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，將上述平皿置于紫外燈下的脫色搖床上，打開皿蓋，距離紫外燈管30cm，照射3min（單號(hào)排）或者6min（雙號(hào)排），蓋上皿蓋。(3)稀釋菌液：在超凈臺(tái)內(nèi)，將照射后的菌懸液用無(wú)菌水按10倍稀釋法依次稀釋成10-1-10-5（在dorf管中進(jìn)行）。(4)涂布平板：取10-3、10-4（單號(hào)組）和10-4、10-5（雙號(hào)組）兩個(gè)稀釋度的菌懸液各0.1ml涂布均勻。以同樣的操作，取未經(jīng)紫外線解決的菌懸液稀釋涂布平板作為對(duì)照。平板于37℃倒置培養(yǎng)48h(用黑布包好平板)。1.43計(jì)算成活率和致死率a.存活率將培養(yǎng)48h后的平板取出進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)平板上菌落數(shù)，計(jì)算出對(duì)照樣品1mL菌液中的活菌數(shù)。b．致死率將培養(yǎng)48h后的平板取出進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)平板上菌落數(shù)，計(jì)算出對(duì)照樣品1mL菌液中的活菌數(shù)。1.44觀察誘變效應(yīng)在平板菌類計(jì)數(shù)后，分別向菌落數(shù)在5~6個(gè)左右的平板內(nèi)加入碘液，分別測(cè)量透明圈直徑與菌落直徑并計(jì)算比值(H/C值)，與對(duì)照平板進(jìn)行比較（紫外照射和對(duì)照組隨機(jī)選出6個(gè)算平均值）。選用H/C比值大的菌落移接到新鮮牛肉膏斜面上培養(yǎng)，用于復(fù)篩。理解微生物分類與鑒定中的基本程序和常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)與辦法；2.熟悉16SrRNA基因PCR擴(kuò)增進(jìn)行細(xì)菌鑒定的基本原理并初步掌握PCR的操作技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)成果21765431.26觀察水解圈的產(chǎn)生并測(cè)其半徑。2176543半徑：1號(hào)2號(hào)3號(hào)4號(hào)5號(hào)6號(hào)7號(hào)2.5mm2.5mm4mm無(wú)水解圈1.5mm0.5mm0.5mm后期實(shí)驗(yàn)選用的為三號(hào)。

1.29不同條件對(duì)菌體生長(zhǎng)量影響的測(cè)定分別統(tǒng)計(jì)多個(gè)不同培養(yǎng)基和不同培養(yǎng)條件下OD600值大小，評(píng)價(jià)對(duì)菌體生長(zhǎng)量的影響。培養(yǎng)基類型OD600值牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（30℃培養(yǎng)）0.770牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（18℃培養(yǎng)）0.913牛肉膏檸檬酸鈉培養(yǎng)基（30）0.440牛肉膏硝酸鈉培養(yǎng)基（30）0.770牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基pH4（30）0.0051.31產(chǎn)淀粉酶待檢菌的培養(yǎng)特性與形態(tài)特性的觀察與鑒定1.培養(yǎng)特性的觀察：菌落形狀與大小，邊沿，表面，隆起形狀，透明度，菌落與培養(yǎng)基顏色等；小而均勻、單個(gè)分散、較濕、表面突起、不透明呈白色。2.細(xì)菌細(xì)胞的顯微觀察：細(xì)胞形狀是桿狀（長(zhǎng)桿或短桿）還是球狀？有無(wú)芽孢？有無(wú)莢膜？細(xì)菌細(xì)胞是桿狀，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜。ResultofG-3.細(xì)菌的革蘭氏染色：按照實(shí)驗(yàn)二的操作辦法進(jìn)行（設(shè)立原則的革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌為對(duì)照）。ResultofG-1.35序列比對(duì)分析T-3C-4C-3T-31.43計(jì)算成活率和致死率T-3C-4C-3T-3T-4T-4C-3C-4T-3T-4菌落個(gè)數(shù)41255a.存活率將培養(yǎng)48h后的平板取出進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)平板上菌落數(shù)，計(jì)算出對(duì)照樣品1mL菌液中的活菌數(shù)。實(shí)驗(yàn)誤差較大，無(wú)法計(jì)算存活率。b．致死率將培養(yǎng)48h后的平板取出進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)平板上菌落數(shù)，計(jì)算出對(duì)照樣品1mL菌液中的活菌數(shù)。實(shí)驗(yàn)誤差較大，無(wú)法計(jì)算致死率。1.44觀察誘變效應(yīng)在平板菌類計(jì)數(shù)后，分別向菌落數(shù)在5~6個(gè)左右的平板內(nèi)加入碘液，分別測(cè)量透明圈直徑與菌落直徑并計(jì)算比值(H/C值)，與對(duì)照平板進(jìn)行比較（紫外照射和對(duì)照組隨機(jī)選出6個(gè)算平均值）。C-4C-3C-4C-3T-4T-3T-4T-3首先目視水解圈較大且無(wú)明顯變化。標(biāo)志測(cè)量成果以下(大小均為直徑，單位mm)：菌落序號(hào)123456菌落大小3321.51.52水解圈大小10910111011H/C值3.333.005.007.336.665.50菌落來(lái)源t-4t-4c-4t-3t-3c-3H/C值的平均值為5.13.測(cè)量成果顯示，-4的菌落經(jīng)6MIN紫外照射后H/C值有略微的變大。-3的菌落有略微的變小。三、討論：1、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制過(guò)程中的注意事項(xiàng)a牛肉膏慣用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時(shí)如稍微加熱，牛肉膏便會(huì)與稱量紙分離，然后立刻取出紙片。本實(shí)驗(yàn)中用的是后一種辦法。b蛋白胨很易吸潮，在稱取時(shí)動(dòng)作要快速。c稱藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈、擦干，再稱取另一藥品，瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。d在瓊脂溶化的過(guò)程中，需不停攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯破裂。最后補(bǔ)足所失的水分。e調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測(cè)量\o"培養(yǎng)基"培養(yǎng)基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向\o"培養(yǎng)基"培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測(cè)其pH值，直至pH達(dá)7.0～7.2。反之，則用1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。盡量pH值不要調(diào)過(guò)頭，以避免回調(diào)，否則，將會(huì)影響\o"培養(yǎng)基"培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。在本實(shí)驗(yàn)中明顯看到培養(yǎng)基顏色較清?？赡芤蛩厥撬^(guò)多。2、第二次斜面劃線較第一次有很大的進(jìn)步，經(jīng)驗(yàn)以下：劃線時(shí)調(diào)取菌落應(yīng)適量，不要貪多，劃線速度與密度應(yīng)慢一點(diǎn)，不規(guī)定快，但過(guò)慢也不行，力度應(yīng)使接種環(huán)剛接觸培養(yǎng)基表面，技術(shù)成熟度方面還需要多加實(shí)踐與總結(jié)。3、培養(yǎng)基配好后為什么要立刻滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無(wú)菌的？培養(yǎng)基本身就是用來(lái)培養(yǎng)細(xì)菌的，里面的營(yíng)養(yǎng)成分很適合細(xì)菌的生長(zhǎng)，不立刻來(lái)菌，細(xì)菌就會(huì)在里