曲酸對細菌的生物活性研究

曲酸對細菌的生物活性研究

曲線酸是一種含有酶分解的親水酸，適用于食品加工。曲酸與目前在食品添加劑中廣泛應用的苯甲酸、山梨酸及其鹽類比有如下優(yōu)點:水溶性好,無需先溶解于有機溶液中再添加到食品中;對人體無刺激性,并可抑制亞硝酸鹽生成致癌物;不為細菌所利用,抗菌效力更強、更廣泛。曲酸的抑菌作用和作為防腐劑的應用已有一些相關報道,本研究中針對曲酸對于食品中常見污染菌的抑制作用進一步進行系統(tǒng)研究,比較,確定了曲酸對各種供試菌的抑制程度及其相應最小抑菌濃度,從而為曲酸在食品方面的應用提供實驗依據。1材料和方法1.1菌株salm細菌5種:大腸桿菌(Escherichiacoli),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),豬傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi),銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa),枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis);酵母2種:啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae),產朊假絲酵母(Candidautilis);霉菌2種:桔青霉(Penicilliumcitrinum),黑曲霉(Aspergillusniger),均為本學院微生物實驗室保藏菌株。1.2金屬絲樣品由廈門市合成生物工程技術有限公司提供,經檢測純度>99%。1.3培養(yǎng)基(1)液體培養(yǎng)基細菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,酵母和霉菌采用5°P的麥芽汁作為培養(yǎng)基。(2)固體培養(yǎng)基用上述液體培養(yǎng)基加2%的瓊脂制成。1.4無菌試驗方法(1)細菌和發(fā)酵菌的激活將各供試細菌和酵母菌種分別接種于新配制的液體培養(yǎng)基中,適宜溫度下(細菌37℃,酵母菌28℃)培養(yǎng)24h后,制成菌懸液。(2)培養(yǎng)基的制備分別取上述細菌、酵母菌的菌懸液2mL加入到裝有60mL液體培養(yǎng)基(分別含有0.2%或0.3%的曲酸)的300mL三角瓶中,并以不加曲酸的培養(yǎng)基作為對照,37℃(細菌)或28℃(酵母菌)搖床培養(yǎng),每隔6h測定一次吸光度值A560nm,連續(xù)測定9次。(3)角瓶培養(yǎng)基的制備將上述供試的桔青霉、黑曲霉斜面活化制成孢子懸浮液,搖勻后各取2mL接種到裝有內含0.5%曲酸的60mL麥芽汁培養(yǎng)基的300mL三角瓶中,同樣以不加曲酸的培養(yǎng)基作為對照。28℃搖床培養(yǎng),每隔12h各取一瓶培養(yǎng)液,3000r/min離心10min,再用蒸餾水洗滌3次,105℃烘干至恒重,稱量并計算菌體干重。1.5生長曲線測定mic值上述各細菌或酵母的菌懸液以及霉菌的孢子懸浮液分別取0.1mL涂布到含有不同曲酸量的平板上,37℃(細菌)或28℃(酵母菌、霉菌)下培養(yǎng),每隔24h觀察各平板菌落的生長情況并計算MIC值。曲酸濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。1.6曲酸平板的制備將濃度為2.5%的曲酸母液分別置于80℃、100℃和121℃處理30min后,定量加入到各培養(yǎng)基中,制成含0.2%和0.4%的曲酸平板,同MIC測定法進行抑菌比較試驗。1.7平板式菌株的制備采用濾紙圓片法。圓濾紙片是將102型濾紙用打孔器制成直徑為10mm的圓片,121℃滅菌后備用。上述各菌株的菌懸液或孢子懸浮液0.1mL加入各適溫培養(yǎng)基,傾注平板后,用無菌鑷子將分別在1%曲酸溶液或1%苯甲酸鈉溶液中浸泡10min的濾紙片貼注平板,并以無菌水作為對照。每菌株平行3個平板,37℃(細菌)或28℃(酵母菌、霉菌)培養(yǎng)24h(細菌)和48h(酵母菌、霉菌)后,觀察抑菌效果并測量抑菌圈大小。2結果與討論2.1曲線酸的抗菌性2.1.1曲酸對銅綠假單胞菌生長和抑制作用的影響實驗首先采用分光光度法比較了曲酸對于4種經常性引起食品污染的細菌大腸桿菌、豬傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑制作用效果,結果如圖1～圖4所示。從圖1～圖4的動態(tài)觀察測試結果可以看出,曲酸對這4種細菌均有明顯的抑制作用,且隨著曲酸的濃度提高,抑菌作用效果逐漸加強。這其中,曲酸對革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌能力明顯強于對革蘭氏陰性的大腸桿菌和豬傷寒沙門氏菌的抑菌能力。當曲酸濃度為0.2%和0.3%時,革蘭氏陰性菌在培養(yǎng)過程中仍有一定生長,而革蘭氏陽性菌,特別是銅綠假單孢菌幾乎不生長,2菌體生長曲線基本上重合在一起。為了進一步研究曲酸對銅綠假單胞菌的抑制作用,把曲酸的濃度降低到0.1%和0.05%,實驗結果見圖5。從圖5低濃度曲酸對銅綠假單胞菌的抑菌曲線中可以看出,曲酸對銅綠假單胞菌的抑菌功能最好,0.1%的曲酸就可以起到根本性地抑制銅綠假單胞菌生長的良好作用效果。另外,圖6和圖7表示了曲酸對于2種酵母菌啤酒酵母、產朊假絲酵母菌生長抑制作用的分光光度法試驗結果。從圖7結果可見,曲酸對產朊假絲酵母有較好的抑制作用,0.3%曲酸呈現出明顯的作用結果。但對于啤酒酵母,實驗觀察到盡管在搖床培養(yǎng)液中加入了一定濃度的曲酸,但是隨著時間的延長也會跟未加曲酸的對照培養(yǎng)液一樣,很快變?yōu)榛鞚?。在培養(yǎng)18h后,添加曲酸的試樣和未加曲酸的對照組同樣都要經過稀釋30倍才能測出其吸光度值A560nm,這說明濃度為0.3%的曲酸對啤酒酵母的抑制作用不明顯。實驗后來發(fā)現0.8%和1.0%濃度的曲酸可以表現出對啤酒酵母菌體生長的明顯影響作用。2.1.2曲酸對設計植物的抑制作用實驗隨后采用菌體量法比較了曲酸對桔青霉和黑曲霉的抑制作用,其結果見圖8和圖9。從圖8和圖9可見,當培養(yǎng)液中曲酸的濃度為0.5%時,桔青霉和黑曲霉試驗組的菌體量曲線與未加曲酸的對照組曲線幾乎完全相重合,表明曲酸對桔青霉和黑曲霉的生長不施加任何抑制作用,有報道稱包括曲霉和青霉的多數絲狀真菌能在通常條件下合成產生一定量的曲酸,因而在菌體細胞內可能已經形成了相應的曲酸對抗或耐受機制體系,上述現象可能與此有關。2.2曲酸對三種細菌生長的影響選用大腸桿菌、豬傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母菌、啤酒酵母菌、桔青霉和黑曲霉8種菌,測定曲酸抑制的MIC,結果見表1。與上面結果一樣,雖然曲酸未能表現出對于青霉和黑曲霉菌體生長的影響作用(在最高試驗濃度為0.6%情況下效果也很不明顯),而對于啤酒酵母,曲酸濃度需高達0.5%時,方有較好的抑制作用,其MIC定為0.5%。但是,當培養(yǎng)基中曲酸含量達到0.3%時,曲酸對于其他各供試菌均有很好的抑菌效果,其中,曲酸對銅綠假單胞菌的抑制作用最顯著,0.1%就能達到很強的抑制作用,但從其完全抑制該菌生長的實驗結果上看,可以確定其MIC為0.2%。對其他3種細菌大腸桿菌、豬傷寒沙門氏菌和枯草芽孢桿菌也表現出尚佳的抑制效果,MIC分別為0.3%、0.4%和0.4%。同樣,曲酸對假絲酵母的抑菌效果也較好,MIC為0.2%濃度的曲酸就能達到徹底的抑菌作用。2.3曲酸對細菌和酵母菌生長的影響從表2可以看出,曲酸經80℃、100℃和121℃處理30min后,再以上述MIC測試方法進行抑菌實驗的結果顯示,熱處理后曲酸的抑菌效果與未經熱處理的曲酸的抑菌效果相同,仍有良好的抗菌效力,說明曲酸對熱穩(wěn)定性良好,可與加工食品共同加熱滅菌,這對曲酸在各種食品中的實際應用十分有利。由表3知,與曲酸一樣,相同1%濃度的苯甲酸鈉亦未能呈現出對于曲霉和青霉的任何抑制作用,但是,曲酸抑制細菌和酵母菌繁殖生長的能力明顯強于苯甲酸鈉。苯甲酸鈉不能對于酵母菌的生長給予任何可觀察到的有效影響,而曲酸則對產朊假絲酵母表現出非常清楚的抑菌效果,對啤酒酵母也有一個微小的作用結果。并且曲酸能夠對于苯甲酸鈉不能起到影響能力的豬傷寒沙門氏菌呈現出了清晰透亮的抑菌圈,同為革蘭氏陰性菌的大腸桿菌,其抑菌圈直徑超過了11mm。在其他細菌的抑菌圈直徑上,二者之間也至少存在0.5mm以上的距離差別,即苯甲酸鈉與曲酸的抑菌作用效果濃度之間,大約相差0.1%以上的等級差異。2.4結果采用濾紙圓片法對曲酸和苯甲酸鈉的抑菌能力進行了試驗比較,結果如表3所示。另外,實驗中為了防止瓊脂不凝固,培養(yǎng)基pH都調為中性,而曲酸和苯甲酸鈉的抑菌效果在酸性或偏酸性的條件下才較強,所以,本實驗也說明曲酸的抑菌pH范圍較廣。3曲酸及抗菌活性(1)曲酸對食品中常見的細菌、酵母菌有較好的抑制作用,特別對細菌的抑制效果更明顯,0.2%～0.4%的曲酸就能對各供試細菌起到很好的抑制作用。曲酸對銅綠假單胞菌的抑制作用顯著,0.1%就能達到很強的抑制作用;曲酸對產朊假絲酵母有較好的抑制作用,0.2%的曲酸可以