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芬蘭畜禽腸道微生物的特性
1動(dòng)物腸道微生物菌群的概念動(dòng)物胃中的微生物是一個(gè)獨(dú)特且多變的生態(tài)系統(tǒng)。這也是發(fā)現(xiàn)的生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)胞密度最高的系統(tǒng)之一(后門,2005)。盡管該系統(tǒng)中積聚著大量的微生物,同時(shí)細(xì)菌與宿主細(xì)胞之間緊密地接觸在一起,但據(jù)認(rèn)為這對(duì)正常的腸道微生物菌群非常有利。腸道微生物積極地同連接免疫細(xì)胞的黏膜相互作用(Umesakit和Setoyama,2000)。非病原性的腸道正常微生物也能保護(hù)腸道免受有害微生物的侵染,宿主和微生物菌群的共生可促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體的健康,提高動(dòng)物的生產(chǎn)力(Hopper,2000)。畜禽生產(chǎn)過程中所應(yīng)用的抗生素生長(zhǎng)促進(jìn)劑(AGPs)不僅能有效地抑制特定的胃腸道感染,而且能夠打亂宿主與腸道微生物之間的正常平衡(Dibner,2005)。長(zhǎng)期以來人們忽視了動(dòng)物健康的維持,而宿主和微生物之間的平衡則是動(dòng)物健康的第一步。但是,最近AGPs的禁用激發(fā)了人們保護(hù)和控制腸道正常微生物的欲望。在最新的微生物菌群強(qiáng)化方法中,第一步是描繪正常微生物菌群的特性。對(duì)存在著許多未知種類的微生物以及無數(shù)可變因素的腸道微生物菌群進(jìn)行研究是比較困難的,而且由于傳統(tǒng)分析方法(如細(xì)菌培養(yǎng))的不完備,造成了人們對(duì)腸道正常微生物菌群組成的了解在很大程度上仍然是個(gè)未知數(shù)。近20年來,建立在探測(cè)細(xì)菌核酸基礎(chǔ)上的研究方法使人們能夠?qū)ξ⑸飬^(qū)進(jìn)行更詳細(xì)的分析,但是人們?cè)絹碓较M苡酶婧透?jiǎn)明的方法描述腸道微生物菌群(Zoetendal,2004)。在芬蘭的研究項(xiàng)目中,一種專用于細(xì)菌菌群的快速流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)方法被用于分析腸道樣本中的細(xì)菌組成(Vaahtovuo,2005)。該項(xiàng)研究的目的是研究動(dòng)物腸道微生物菌群的特性,并探索不同的飼料原料和添加劑對(duì)腸道微生物區(qū)和動(dòng)物機(jī)體消化率的影響。將獲得的該獨(dú)特的知識(shí)和信息用于揭示微生物區(qū)的菌群組成與腸道健康狀況和動(dòng)物生產(chǎn)力之間的關(guān)系。作為一個(gè)該微生物菌群強(qiáng)化理論可行性驗(yàn)證,我們提出了微生物平衡指數(shù)(MicrobialBalanceIndex,MBI)這一概念。2糞樣及細(xì)菌分析為了研究正常糞便中微生物菌群的組成,分別從224頭10周齡仔豬和256頭16~20周齡生長(zhǎng)豬中采集各頭試驗(yàn)豬的糞便樣本,樣本采集后不進(jìn)行混合。試驗(yàn)豬飼養(yǎng)在正常的生產(chǎn)條件下,同時(shí)參加飼喂數(shù)種不同飼料組成的飼養(yǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)豬分?jǐn)?shù)個(gè)飼喂組(其中試驗(yàn)仔豬分17個(gè)組,生長(zhǎng)豬組分16組),每組有12~18頭豬。試驗(yàn)時(shí)測(cè)定每組豬的平均日增重(DWG)。另外,為研究水解啤酒酵母ProgutTM(芬蘭SuomenRehu公司生產(chǎn))對(duì)糞便中微生物菌群和動(dòng)物生長(zhǎng)的影響究,特收集60頭10周齡仔豬的糞便樣本。試驗(yàn)時(shí)將這60頭10周齡仔豬分成5個(gè)飼喂組,每組12頭;其中2個(gè)組的仔豬從5周齡開始飼喂常規(guī)的斷奶料(對(duì)照料),另3個(gè)組的仔豬飼喂相同的斷奶料,但在斷奶料中添加水解酵母(試驗(yàn)料)。分別測(cè)定各組仔豬的平均日增重。糞便樣本采集后,進(jìn)行細(xì)菌細(xì)胞分離,并利用一種基于FCM、16S-rRNA雜交技術(shù)和DNA染色技術(shù)的方法進(jìn)行分析(Vaahtovuo,2005)。糞樣保存在磷酸鹽緩沖鹽水(Phosphate-BufferedSaline,PBS)中,細(xì)菌用離心法分離。細(xì)菌細(xì)胞用多聚甲醛定型后,再用PBS沖洗數(shù)次,重新保存在含50%乙醛的PBS中。定型后的細(xì)菌細(xì)胞置于-20℃冰箱保存,用能作為各種細(xì)菌屬和細(xì)菌群靶子的核苷酸探針進(jìn)行分子雜交(Lay,2005;Sghir,2000;Suau,2001),隨后根據(jù)SYTOX誖DNA染色法(分子探針,美國(guó)俄勒岡州尤金公司生產(chǎn))染色,用流式細(xì)胞術(shù)分析。此外,統(tǒng)計(jì)總細(xì)菌數(shù)(DNA染色的細(xì)菌數(shù)量),以綜合方式描述微生物菌群的MBI值可根據(jù)以下方程(專利保護(hù))計(jì)算獲得:MBI=(A+B)/(C+D)。式中:A為雙歧桿菌數(shù);B為糞球菌屬細(xì)菌(FaecalibacteriumPrausnitzii)數(shù);C為類桿菌屬-卟啉菌屬-普氏菌屬菌群(BacteroidesPorphyromonasPrevotellagroup)的細(xì)菌數(shù);D為腸道菌群細(xì)菌數(shù)。分別對(duì)每個(gè)樣本的細(xì)菌數(shù)量和微生物平衡指數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。利用t-檢驗(yàn)分析兩個(gè)具有不等方差的獨(dú)立樣本集,用Pearson氏相關(guān)系數(shù)和回歸分析法評(píng)估微生物平衡指數(shù)與平均日增重間的相關(guān)性,所有分析結(jié)果的顯著性差異均設(shè)為P<0.05。3水解酵母對(duì)東南角水生動(dòng)物的影響圖1列出流式細(xì)胞術(shù)分析實(shí)例。在圓點(diǎn)圖中,x軸表示探針雜交目標(biāo)細(xì)菌的熒光點(diǎn)數(shù),y軸表示DNA-染色的熒光點(diǎn)數(shù)。細(xì)菌分離自非DNA-染色的樣本材料,已雜交的目標(biāo)細(xì)菌可與樣本中其他細(xì)菌區(qū)別出來。圖2列出了微生物平衡指數(shù)和平均日增重間的相關(guān)性。無論是仔豬還是生長(zhǎng)豬中,兩者的相關(guān)系數(shù)均達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異(仔豬:r=0.68,r2=0.46,P≤0.01;生長(zhǎng)豬:r=0.68,r2=0.46,P≤0.01)。表2列出了水解酵母對(duì)仔豬微生物平衡指數(shù)和平均日增重的影響。仔豬飼喂含水解酵母的飼料后,其平均日增重和微生物平衡指數(shù)均明顯提高。不過與對(duì)照組相比并沒達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異(平均日增重:P=0.07,微生物平衡指數(shù):P=0.20)。4腸道微生物菌群的組成芬蘭研究項(xiàng)目中所采用的流式細(xì)胞術(shù)方法能夠獲得有關(guān)腸道菌群的比較全面的數(shù)據(jù)。流式細(xì)胞術(shù)分析法具有快速、可靠的特點(diǎn),并有很高的數(shù)值解析率(numericalresolution)。該獨(dú)特的方法是建立在檢測(cè)整個(gè)細(xì)菌細(xì)胞基礎(chǔ)上的,且不依賴于會(huì)使分析結(jié)果失去真實(shí)性的細(xì)菌培養(yǎng)或核苷酸的提取和擴(kuò)增。所獲得的結(jié)果驗(yàn)證了腸道正常微生物菌群在動(dòng)物生長(zhǎng)過程中逐漸成長(zhǎng)并且由某些細(xì)菌菌種及菌屬按宿主動(dòng)物特有的比例組成(Conway,1997)。盡管仔豬和生長(zhǎng)豬的糞便在細(xì)菌組成上有著明顯相似性,但其微生物特性同樣揭露了不同年齡組間存在著明顯差異。無論是仔豬還是生長(zhǎng)豬,類桿菌屬-卟啉菌屬-普氏菌屬菌群是腸道糞便中第一大菌群,但是,細(xì)菌數(shù)量和所占比例上的變化表明,不同年齡段仔豬在腸道微生物菌群上存在著明顯的差異。隨仔豬年齡的增長(zhǎng),類桿菌屬-卟啉菌屬-普氏菌屬群菌、雙歧桿菌和普拉梭桿菌的數(shù)量逐漸減少,而腸道細(xì)菌群的數(shù)量并未發(fā)生變化,柔嫩梭菌的數(shù)量逐漸增多,但細(xì)菌總數(shù)基本保存不變。用以分析的樣本采自在正常生產(chǎn)條件下飼養(yǎng)的試驗(yàn)豬,且飼喂了數(shù)種不同的飼料,因此,該結(jié)果可以代表仔豬和生長(zhǎng)豬在正常飼養(yǎng)條件下腸道微生物菌群的組成。腸道微生物菌群是一個(gè)極復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng),要描述其組成是相當(dāng)困難的,而用微生物平衡指數(shù)來描述則顯得簡(jiǎn)潔且全面。微生物平衡指數(shù)是通過計(jì)算腸道內(nèi)4種主要細(xì)菌菌種的比例獲得,因此,即使是那些沒有直接測(cè)定其所占比例的細(xì)菌也會(huì)影響微生物平衡指數(shù),了解這一點(diǎn)是非常重要的。微生物菌群是一個(gè)具有固有平衡能力的整體,并且某些微生物菌種所占比例發(fā)生了變化不可避免地會(huì)影響其他微生物的比例。微生物平衡指數(shù)能使復(fù)雜的微生物菌群變成一個(gè)簡(jiǎn)潔易懂的概念,而且特別適用于監(jiān)控腸道微生物菌群的變化。有關(guān)微生物平衡指數(shù)和動(dòng)物生長(zhǎng)之間相互關(guān)系的研究結(jié)果具有極其重要的意義,表明了腸道微生物菌群的組成對(duì)動(dòng)物福利及其生產(chǎn)力會(huì)產(chǎn)生十分重要的影響。在這些飼養(yǎng)試驗(yàn)中,可以用估計(jì)得到的微生物平衡指數(shù)公正地(r2=0.46)解釋平均日增重中的變異。研究表明,水解酵母能提高微生物平衡指數(shù),促進(jìn)仔豬的生長(zhǎng)。該研究結(jié)果是一個(gè)利用日糧方法通過調(diào)整腸道微生物菌群提高動(dòng)物生產(chǎn)力的有應(yīng)用價(jià)值的實(shí)例。經(jīng)常有報(bào)道,新型功能性飼料和功能性添加劑對(duì)細(xì)菌有特定的作用,但它們對(duì)整個(gè)腸道微生物菌群的重要性更應(yīng)受到重視,因?yàn)槟c道微生物是影響宿主動(dòng)物生理和免疫狀況的重要因素。本文所介紹的腸道菌群分析方法和微生物平衡指數(shù)概念將有助于評(píng)估AGP替代品對(duì)動(dòng)物體內(nèi)微生物的作用,并可促進(jìn)基于控制和調(diào)整腸道微生物菌群的新型飼料和新型飼喂方案的開發(fā)。表1列出了糞便樣本中的細(xì)菌群,仔豬和生長(zhǎng)豬糞便中的細(xì)菌總數(shù)處于相同的水平:每克干糞樣的細(xì)菌含量分別為1.5×1011個(gè)和1.4×1011個(gè)。對(duì)細(xì)菌群研究表明,類桿菌屬-卟啉菌屬-普氏菌屬細(xì)菌的菌群是糞便中最普通的菌群,仔豬和生長(zhǎng)豬每克糞樣中的
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